2019—2020年上海地區兒童幽門螺桿菌感染及其耐藥性分析

李春玲，何磊燕，付盼，陳賽閣，王愛敏，張蕾，王傳清

復旦大學附屬兒科醫院，上海 201102

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是一種定植在胃黏膜表層的革蘭氏陰性微需氧菌，被世界衛生組織(World Health Organization，WHO)定為Ⅰ類致癌物，全球約有一半人口感染[1]。兒童幽門螺桿菌感染往往發生在兒童早期，與慢性胃病及消化性潰瘍的發生有關，多數患兒發展成慢性淺表性胃炎，無明顯臨床癥狀，少數發展成十二指腸潰瘍[2]。有研究認為兒童感染幽門螺桿菌可能出現生長發育不良等問題[3-5]。目前，在幽門螺桿菌根除治療方案中，臨床常用胃三聯或四聯療法，用于兒童幽門螺桿菌感染根除治療的抗菌藥物有甲硝唑、克拉霉素及阿莫西林。然而，隨著近年來抗菌藥物的廣泛使用，兒童感染幽門螺桿菌的耐藥問題日益加重。

本研究以2019—2020年于復旦大學附屬兒科醫院就診的幽門螺桿菌感染患兒為研究對象，回顧性分析分離的幽門螺桿菌對甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星的敏感性，監測上海地區兒童感染幽門螺桿菌的耐藥狀況，從而為臨床根治幽門螺桿菌過程中合理使用抗菌藥物提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

主要材料包括哥倫比亞平板(含5%綿羊血)(法國生物梅里埃公司)、微需氧產氣袋(上海科馬嘉微生物技術有限公司)、羊血M-H培養基(上海伊華生物科技有限公司)、E-test試紙條(溫州市泰康生物科技有限公司)、MALDI-TOF生物質譜儀(法國生物梅里埃公司)。

1.2 幽門螺桿菌的分離培養及鑒定

收集2019年1月—2020年10月于復旦大學附屬兒科醫院行胃鏡檢查的1 605例患兒的胃黏膜組織標本各1塊(小米粒大小)，于0.5 mL布氏肉湯中研磨成勻漿，接種于哥倫比亞平板，迅速置于微需氧環境(5% O2、10% CO2和85% N2)中37 ℃培養3～6 d，觀察菌落形態。取半透明且細小的菌落行革蘭染色鏡檢(彎曲狀、海鷗狀的短小陰性桿菌)、尿素酶試驗(陽性)、觸酶試驗(陽性)、氧化酶試驗(陽性)、硝酸鹽還原試驗(陰性)及MALDI-TOF生物質譜儀分析，確證為幽門螺桿菌。

1.3 體外藥敏試驗

用無菌棉簽取幽門螺桿菌菌落，配制2麥氏濁度的菌懸液，再用棉簽均勻涂布于含5%綿羊血的M-H培養基，將甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星E-test試紙條置于平板，迅速置于37 ℃微需氧環境(5% O2、10% CO2和85% N2)培養3 d，讀取藥敏結果。判讀標準根據美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2019版及歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)標準[6-7]制定，阿莫西林、左氧氟沙星、克拉霉素和甲硝唑的耐藥折點分別為>0.125 mg/mL、>1 mg/mL、>0.5 mg/mL、>8 mg/mL。質控菌株為幽門螺桿菌標準菌株ATCC 43504。

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行數據分析，耐藥率比較采用χ2檢驗，理論頻數小于1時，采用Fisher確切概率法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 幽門螺桿菌的分離率

從本研究入組的 1 605 份患兒胃黏膜標本中共分離出幽門螺桿菌506株，總陽性率為31.5%，其中2019年、 2020年幽門螺桿菌培養陽性率分別為30.8%(356/1 155)、33.3%(150/450)。男性患兒的幽門螺桿菌培養陽性率為31.5%(287/910)，女性患兒為31.5% (219/695)，無統計學差異(χ2= 0.00，P=0.99)。將患兒按學齡分成4組：1～3歲(學前階段)、4～6歲(幼兒園階段)、7～12(小學階段)、13～16(中學階段)，各組幽門螺桿菌培養陽性率分別為25.0% (15/60)、29.0%(114/393)、32.1%(300/934)、35.3%(77/218)，無統計學差異(χ2=3.945，P=0.267，見表1)。

表1 不同年齡患兒的幽門螺桿菌陽性率

2.2 幽門螺桿菌對4種抗菌藥物的耐藥率

幽門螺桿菌對甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林的總體耐藥率分別為42.3%、25.1%、8.1%、3.0%，對甲硝唑和克拉霉素的耐藥率明顯高于左氧氟沙星和阿莫西林(χ2=306.192，P<0.01，見表2)。

表2 幽門螺桿菌對4種抗菌藥物的敏感性 [n(%)]

2.3 影響幽門螺桿菌耐藥率的因素

2.3.1 幽門螺桿菌耐藥率與患兒性別的關系幽門螺桿菌對甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星和阿莫西林的耐藥率在男、女患兒之間均無統計學差異(見表3)。

表3 男、女患兒的幽門螺桿菌對4種抗菌藥物的耐藥率 [n(%)]

2.3.2 幽門螺桿菌耐藥率與患兒年齡的關系幽門螺桿菌對阿莫西林、左氧氟沙星和甲硝唑的耐藥率在各年齡段患兒之間無統計學差異(分別為χ2=2.506，P=0.474；χ2=1.532，P=0.675；χ2=2.854，P=0.46)。但值得注意的是，4組患兒對克拉霉素的耐藥率分別為13.3%、21.1%、25.7%、31.2%，其中13～16歲患兒對克拉霉素的耐藥率顯著高于1～3歲患兒(P=0.040，見表4)。

表4 幽門螺桿菌耐藥率與患兒年齡的關系[n(%)]

2.4 幽門螺桿菌雙重耐藥及多重耐藥分析

本研究分離到的506株幽門螺桿菌中，203株對4種抗生素均敏感，占40.1%。進行雙重耐藥和多重耐藥分析，發現雙重耐藥有5種情況：克拉霉素+甲硝唑、克拉霉素+左氧氟沙星、甲硝唑+左氧氟沙星、甲硝唑+阿莫西林、阿莫西林+左氧氟沙星，耐藥率分別為18.0%、5.1%、4.9%、1.4%、0.8%，其中對克拉霉素+甲硝唑的耐藥率顯著高于其他4種情況(χ2=172.706，P<0.01)。三重耐藥分析顯示，幽門螺桿菌對左氧氟沙星+克拉霉素+甲硝唑的耐藥率為3.0%，顯著高于對左氧氟沙星+阿莫西林+克拉霉素(0.6%)和阿莫西林+甲硝唑+左氧氟沙星(0.6%)的耐藥率(χ2=13.907，P=0.01)。此外，有2例患兒從其中分離的幽門螺桿菌對4種抗菌藥物全耐藥(見表5)。

表5 幽門螺桿菌的雙重耐藥及多重耐藥分析 [n(%)]

3 討論

幽門螺桿菌感染是兒童消化道潰瘍、慢性活動性胃炎等疾病發生的重要誘因[2, 8]，可影響兒童生長發育及學習[9]。有研究表明，幽門螺桿菌感染與口腔疾病的發生及胃內微生態改變具有相關性[10-12]。5歲以下兒童幽門螺桿菌感染率在發達國家約為20%，而在許多發展中國家高達50%[13]，因此控制兒童期幽門螺桿菌感染對兒童健康成長及成人胃癌等疾病的預防具有重要意義。

常用的根除幽門螺桿菌的抗菌藥物有硝基咪唑類、β-內酰胺類、大環內酯類、喹諾酮類等，但近年來其對抗菌藥物的耐藥性逐漸增強，根除率呈下降趨勢[14]。本研究將入組患兒按學齡分成4組，即1～3歲組(學前階段)、4～6歲組(幼兒園階段)、7～12歲組(小學階段)和13～16歲組(中學階段)，各組幽門螺桿菌培養陽性率分別為25.0%(15/60)、29.0%(114/393)、32.1%(300/934)和35.3%(77/218)，各組之間無統計學差異。而黃潔等[15]采用C尿素呼氣試驗對上海市閔行區 1 988 名7～18歲中小學生進行調查分析，發現幽門螺桿菌感染率隨年齡增長呈上升趨勢，小學、初中、高中組感染率分別為27.4%、33.6%、45.1%。

甲硝唑屬于硝基咪唑類抗菌藥物，曾被推薦為根除幽門螺桿菌的首選藥物，但近年來其全球耐藥率逐漸升高，尤其是在發展中國家(全球耐藥率為20%～95%)[16]。國內報道兒童幽門螺桿菌對甲硝唑的耐藥率也較高，為34.4%～75.2%[7, 14, 17-19]。本研究分離的幽門螺桿菌對甲硝唑和克拉霉素的耐藥率(42.3%、25.1%)明顯高于對左氧氟沙星和阿莫西林的耐藥率(8.1%、3.0%)(χ2=306.192，P<0.01)。

克拉霉素屬于大環內酯類抗菌藥物，全球不同地區幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥率為0～86%[16]，差異較大。Dore等[20]研究發現，當幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥時，其根除率降低55%。本研究中兒童幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥率為25.1%，北京的一項研究報道高達93.3%[18]，而南昌、杭州、貴陽分別為13.3%、20.6%、19.35%[14, 17, 21]，可見地區差異很大，因此各地區應做好本地幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥率基線調查，從而制定合理的根治方案。Maastricht V共識指出，幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥率高于15%～20%及對甲硝唑耐藥率高于40%的地區，不推薦經驗性使用這兩種抗菌藥物用于幽門螺桿菌根治方案，建議先行耐藥試驗[22]。

阿莫西林屬于半合成青霉素類廣譜β-內酰胺類抗菌藥物，幽門螺桿菌對阿莫西林的總體耐藥率在全球差異較大：發達國家較低，而發展中國家相對較高，其中印度高達72.5%[23]。我國將阿莫西林用于根治幽門螺桿菌已有二十多年，耐藥率未顯著增加。已報道我國兒童幽門螺桿菌對阿莫西林的耐藥率較低(0～5%)[7, 14, 17-18, 21, 24]，本研究為3%，與國內整體水平一致，因此推薦阿莫西林作為兒童幽門螺桿菌治療的首選藥物之一。

左氧氟沙星為廣譜氟喹諾酮類抗菌藥物，幽門螺桿菌對其的耐藥率在全球范圍內普遍較低(<20%)，但近年來有升高趨勢。我國兒童幽門螺桿菌對左氧氟沙星的耐藥率較低(5%～17.6%)，可能與我國要求18歲以下兒童慎用氟喹諾酮類藥物有關[24]。

本研究未發現兒童幽門螺桿菌對甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林的耐藥率與性別及年齡相關，與Li等[7]、李東丹等[18]的研究結果一致。但幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥率在4個年齡段患兒中分別為13.3%、21.1%、25.7%、31.2%，有隨年齡增長而升高的趨勢，其中13～16歲患兒顯著高于1～3歲患兒 (P=0.040)。這可能是由于大環內酯類為兒童呼吸道感染治療的常用藥物，而學齡兒童在校期間發生呼吸道感染的概率較高，有研究揭示既往使用過大環內酯類藥物的患者對克拉霉素的耐藥風險增加，從而降低了含克拉霉素的三聯療法對幽門螺桿菌的根除率[25]。

對本研究分離的506株幽門螺桿菌進行雙重及多重耐藥分析，結果顯示其對克拉霉素+甲硝唑的耐藥率最高，達18.0%，三重耐藥中最多的是對左氧氟沙星+克拉霉素+甲硝唑耐藥(15株，3.0%)。但北京的一項研究顯示，兒童幽門螺桿菌對甲硝唑和克拉霉素的雙重耐藥率高達52.30%，遠遠高于杭州地區(11.7%)、江西地區(12.4%)及本研究[14, 17]。此外，本研究發現2例患兒的幽門螺桿菌對4種抗菌藥物均耐藥。

盡管全世界兒童幽門螺桿菌感染率有降低趨勢，但耐藥問題依然非常嚴峻，尤其是對甲硝唑、克拉霉素的耐藥率較高。雖然其對左氧氟沙星的耐藥率較低，但左氧氟沙星不適用于兒童。提示臨床制定幽門螺桿菌治療方案時，應充分了解患兒既往用藥史，推薦先做抗菌藥物耐藥試驗并根據藥敏試驗結果制定個體化治療方案，規范、合理使用抗菌藥物，減少耐藥發生。與此同時，研究者應當集思廣益，探索更多幽門螺桿菌的非抗生素療法，如益生菌、抗菌肽、中醫及納米技術等，從而為提高幽門螺桿菌根除率提供新的思路和依據。