非編碼RNA與轉移性結直腸癌西妥昔單抗耐藥關系的研究進展

楊佳雯 謝雙雙 葉樂馳

轉移性結直腸癌(metastatic colorectal cancer，mCRC)的治療是臨床工作中的重點和難點之一[1]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是上皮生長因子細胞增殖和信號轉導的受體，與腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉移及細胞凋亡的抑制有關。目前，靶向EGFR的單克隆抗體是治療mCRC的一個突破[2]。其代表藥物西妥昔單抗，通過競爭性阻斷EGFR與其配體EGF等的結合,阻斷EGFR下游的信號轉導途徑,進而抑制腫瘤細胞的生存、增殖、侵襲和轉移。經過一系列臨床試驗驗證，西妥昔單抗治療可以增加晚期患者的手術機會，提高mCRC患者的總生存率，已經被成功應用于mCRC的治療[3]。

2008年后一系列臨床研究進一步發現，RAS基因野生型患者從西妥昔單抗治療中獲益更大，這對傳統治療模式的選擇產生了重要影響，使精準化個體治療從愿望走向了現實[4，5]。然而，臨床上仍有部分RAS野生型CRC患者在接受西妥昔單抗治療時出現無效或耐藥[6]?？梢娚钊胙芯课魍孜魡慰鼓退幍臋C制，并進一步尋找潛在的能有效預測靶向治療效果的生物學標志物是十分迫切且有必要的。近年來研究表明，非編碼RNA通過多種機制影響CRC的發生、發展，這也有利于找到更多的生物學標志物，為解決西妥昔單抗耐藥提供很好的思路。

一、非編碼RNA的概述

非編碼RNA是指能從基因組上轉錄但不能翻譯成蛋白質的RNA。根據長度，非編碼RNA可分為長鏈非編碼RNA(>200nt)、微小非編碼RNA(≤200nt)和環狀RNA。非編碼RNA在轉錄、RNA加工和翻譯水平上調節基因表達，且每個非編碼RNA都具有不同的功能，僅在人類基因組中就可能有10000個長鏈非編碼RNA有待研究，因此可以預測，非編碼RNA的數千種新功能有待被發現[7]。過去20年的研究揭示了新類別的非編碼RNA，包括微小RNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)、環狀RNA(circRNA)等，所有這些非編碼RNA都具有不同的調節功能，有效地反饋到更大的RNA通信網絡中，最終調節細胞功能的基本蛋白效應器[8]。

二、與西妥昔單抗耐藥相關的miRNA

miRNA是短的、非編碼的核苷酸序列，其通過與靶mRNA的3′非編碼區(3-UTR)中的互補位點結合來調節基因表達[9]。研究證實，miRNA可通過APC丟失、PTEN/PI3K途徑失調和SRC過表達觸發、促進腫瘤轉化和進展[10]。

1.let-7:let-7家族是人類惡性腫瘤中研究最多的miRNA之一。通常通過下調參與控制細胞周期或細胞內信號級聯的癌基因來充當腫瘤抑制因子[11]。KRAS是let-7的既定靶標，let-7互補位點6(LCS-6)的單核苷酸多態性(SPF)，破壞了let-7結合并上調了KRAS的表達[12]。Zhang等[13]對130例入選西妥昔單抗單藥治療Ⅱ期研究(IMCL-0144)的mCRC患者評估了KRAS、let-7、LCS-6多態性的存在，結果表明KRAS的3′UTR多態性可以預測KRAS野生型mCRC患者西妥昔單抗的反應性。Ruzzo等[14]研究分析了let-7a在用西妥昔單抗治療的具有KRAS突變的mCRC患者中的表達水平，其研究顯示，let-7a的上調可使具有KRAS突變的患者從抗EGFR治療中獲得生存益處，可能潛在地用于改善西妥昔單抗的耐藥。

2.miRNA-181a: miRNA-181a在CRC中可改變Wnt/β-連環蛋白信號轉導。然而，miRNA-181a在CRC中的作用及其預測存活和對靶向EGFR藥物的反應能力尚未被探索。Pichler等[15]對80例接受西妥昔單抗和帕尼單抗治療的KRAS野生型mCRC患者進行了分析。研究表明，miRNA-181a在腫瘤組織中的低表達與KRAS野生mCRC患者中較差的總生存期(OS)和無進展生存期(PFS)相關。Kaplan-Meier曲線顯示出miRNA-181a低表達患者的OS縮短(P=0.019),miRNA-181a低表達還與不良PFS相關(P=0.015)。

3.miRNA-345：miRNA-345是所有患者以及非KRAS突變人群中OS和PFS的單一預后生物學標志物。為研究接受西妥昔單抗和伊立替康治療的mCRC患者的總生存率，Schou等[16]在138例接受西妥昔單抗和伊立替康三線治療的mCRC患者中，從全血中分離并分析了738個預處理miRNA，其中KRAS、BRAF和PIK3CA是突變狀態。結果發現6種miRNA(miRNA-345、miRNA-143、miRNA-34a、miRNA-628-5p、miRNA-886-3p和miRNA-324-3p)與短OS相關。其中miRNA-345是最強的預后miRNA，在整個隊列和非KRAS突變體群體中均具有重要意義。

4.let-7c/miRNA-99a/miRNA-125b: 為評估西妥昔單抗或帕尼單抗治療的兩個不同的mCRC患者隊列中的miRNA表達，并研究miRNA是否可預測mCRC患者對抗EGFR單克隆抗體的敏感度，Cappuzzo等[17]通過納入來自2個獨立隊列(隊列1∶74例，驗證隊列：109例)的西妥昔單抗或帕尼單抗治療的183例mCRC患者，并用分析miRNA序列的方法鑒定了let-7c/miRNA-99a/miRNA-125b是與抗EGFR治療結果不同的標志。在隊列1中，具有高let-7c/miRNA-99a/miRNA-125b表達的患者的PFS和OS明顯更長。在驗證隊列中，具有高表達患者也具有更長的PFS和OS。在KRAS野生型人群(120例)中，高表達患者的PFS和OS也明顯更長。但在KRAS突變患者中比較差異無統計學意義。由此，他們得到let-7c/miRNA-99a/miRNA-125b可改善KRAS野生型mCRC患者的選擇，作為抗EGFR治療的良好候選者的結論。因此let-7c/miRNA-99a/miRNA-125b可能在mCRC西妥昔單抗耐藥中發揮作用，并影響了西妥昔單抗或帕尼妥單抗治療的mCRC患者的PFS和OS。

5.miRNA-31-5p/3p:可能參與調節BRAF的活化并在CRC的EGFR下游的信號通路中發揮作用。Igarashi等[18]研究分析了102例接受抗EGFR治療的CRC患者在EGFR下游途徑中的miRNA-31-5p表達情況。實驗表明，在攜帶所有野生型基因的CRC中，高miRNA-31-5p與較短的PFS相關，表明它可能是抗EGFR治療預后的生物學標志物。Mlcochova等[19]在28例為西妥昔單抗治療的RAS野生型mCRC患者和24例為帕尼單抗治療的RAS野生型mCRC患者中鑒定出9種對西妥昔單抗治療的應答者和無應答者之間表達顯著不同的miRNA。進一步評估成功證實，在用西妥昔單抗治療的患者中高miRNA-31-3p和miRNA-31-5p與低進展時間(TTP)強相關。他們猜測miRNA-31-5p/3p可能是RAS野生型mCRC患者西妥昔單抗應答的預測生物學標志物。Manceau等[20]則研究認為miRNA-31-3p可能是一種新的mCRC生物學標志物，其表達水平可用于識別對抗EGFR治療產生反應的KRAS野生型mCRC患者。綜上所述，miRNA-31-5p/3p有希望成為KRAS野生型mCRC患者抗西妥昔單抗應答的預測性生物學標志物，需要進一步研究。

6.miRNA-133b: miRNA-133b可直接靶向EGFR并抑制其在CRC細胞中的表達水平來抑制CRC細胞的生長和侵襲。Zhou等[21]研究表明，在人CRC組織和細胞系中miRNA-133b表達水平下調。與單獨治療比較，miRNA-133b模擬物和西妥昔單抗的聯合治療顯示出更好的抑制大腸癌細胞生長和侵襲的效果。他們的研究明確了miRNA-133b/EGFR相互作用在大腸癌細胞中的作用，提示西妥昔單抗與miRNA-133b聯合治療大腸癌是積極的，可能是未來治療大腸癌的一種潛在新療法。

7.miRNA-7: miRNA-7是包括CRC在內的所有惡性腫瘤中的腫瘤抑制因子，能有效抑制CRC細胞的增殖。Suto等[22]研究表明miRNA-7可通過抑制EGFR信號轉導改變西妥昔單抗耐藥的HCT116和SW480細胞(含有KRAS突變)和HT29細胞(含有BRAF突變)中的西妥昔單抗敏感度。西妥昔單抗治療不會降低HCT116和SW480細胞的增殖，但在miRNA-7前體處理的HCT116和SW480細胞中，西妥昔單抗的敏感度增加。該研究即使存在KRAS突變，miRNA-7高表達的原發性CRC中的西妥昔單抗敏感度也高于miRNA-7低表達的CRC。因此，miRNA-7可能是CRC中西妥昔單抗耐藥標志物。

8. miRNA-375: 結締組織生長因子(CTGF)是EGFR的配體，且CTGF在大腸癌組織中的表達明顯高于相應的正常結腸組織。Alam等[23]研究證明，miRNA-375的過表達通過降低CTGF表達調節人CRC細胞和組織中的EGFR信號通路，來抑制細胞存活、增殖、遷移和血管生成。此外miRNA-375過表達和西妥昔單抗共同治療的結果顯示它們協同增強了CRC細胞的凋亡和壞死。因此，miRNA-375具有與西妥昔單抗耐藥相關的治療價值。

9. MIR100HG衍生的miRNA-100和miRNA-125b: 原發性耐藥和獲得性耐藥主要是遺傳改變所導致的，而耐藥則是抗EGFR治療的障礙。Lu等[24]在西妥昔單抗耐藥的細胞中發現MIR100HG和兩個衍生的miRNAs(miRNA-100，miRNA-125b)過表達。此外，在西妥昔單抗耐藥的CRC以及在西妥昔單抗治療進展中的CRC患者的腫瘤中也觀察到MIR100HG、miRNA-100和miRNA-125b的過表達。研究人員發現，miRNA-100和miRNA-125b協調抑制著5個Wnt/β-連環通路通路的負調節因子(DKK1、DKK3、ZnFR3、RNF43和APC2)，導致Wnt信號轉導增加，在西妥昔單抗耐藥細胞中通過抑制Wnt可恢復西妥昔單抗的反應性。同時，研究表明MIR100HG和轉錄因子GATA6之間存在雙負反饋回路，轉錄因子GATA6對MIR100HG具有抑制作用，但是這種抑制被以GATA6為靶點的miRNA-125b所解除。這些發現確定了西妥昔單抗臨床可行的表觀遺傳因素。

三、與西妥昔單抗耐藥相關的lncRNA

lncRNA通過干擾miRNA的活性，直接與蛋白質結合來調節它們的活性或改變它們的定位。通過抑制RNA聚合酶影響下游基因表達，以及作為競爭性內源RNA調節基因表達在生物過程中起重要作用[8]。隨著CRC新型分子和表觀遺傳機制的發現，lncRNA已成為診斷、預后和治療中應用價值不斷上升的生物學靶標。近年來也有研究發現，lncRNA在CRC等腫瘤細胞的耐藥中發揮關鍵作用。

1.LINC00973: Jing等[25]建立了西妥昔單抗耐藥細胞系(H508/CR)，并進行了RNA測序，驗證lncRNA的表達水平后，對表達水平上調最顯著的lncRNA分子LINC00973進行RNA-FISH檢測。結果證實，H508/CR細胞中LINC00973表達水平升高。此外，LINC00973抑制作用使葡萄糖消耗和乳酸分泌分別降低。敲低該lncRNA后，細胞活力降低，細胞凋亡增加，葡萄糖消耗和乳酸分泌減少，并可以改善H508細胞對西妥昔單抗的耐藥性。因此，LINC00973表達水平可用于預測西妥昔單抗耐藥性的預后。

2.POU5F1P4: Peng等[26]在西妥昔單抗治療的mCRC隊列中進行了lncRNA表達譜分析。研究發現9種lncRNA差異表達，其中有5種與患者的PFS顯著相關。在這5個lncRNA中，POU5F1P4在獲得性西妥昔單抗耐藥細胞以及西妥昔單抗耐藥患者中均下調。他們對POU5F1P4共表達的蛋白編碼基因進行了研究。9個POU5F1P4共表達基因(AREG、CKB、ERG、MYC、NOX1、SLC39A2、ANO1、CYP3A5和NT5E)在疾病對照組和無應答組之間比較，差異有統計學意義，并發現共表達的基因在EGFR結合上顯著富集。證明POU5F1P4的下調降低了CRC細胞對西妥昔單抗的敏感度。實驗表明了lncRNA在西妥昔單抗耐藥中的潛在作用，并可能為發現新的生物學標志物和治療靶標提供有用的信息。

3.UCA1: 尿路上皮癌相關1(UCA1)是一種具有3個外顯子的lncRNA。Yang等[27]研究發現西妥昔單抗耐藥細胞及其外顯體中UCA1水平的上調。他們從西妥昔單抗敏感的Caco-2細胞中培養出西妥昔單抗耐藥細胞株Caco2-CR，并用檢測UCA1的表達水平。結果顯示Caco2-CR細胞中UCA1的表達明顯高于Caco-2細胞。此外，他們檢測了Caco2-CR細胞(CR-exo)和Caco2-CS細胞(CS-exo)來源的外顯體中UCA1的水平，發現CR-exo中的UCA1水平明顯高于CS-exo，表明UCA1主要集中在Caco 2-CR細胞來源的外顯體中，而且UCA1的表達可能與西妥昔單抗耐藥有關。

四、環狀RNA

環狀RNA(circRNA)是一類非編碼RNA，數以千計的內源性circRNA存在于哺乳動物細胞中，它們通過與miRNA或其他分子結合，然后抑制其功能，在轉錄或轉錄后的水平上調節基因表達，從而影響腫瘤發生和癌癥通路的調節?；赾ircRNA在癌癥中的功能，Qu等[28]和Zhang等[29]研究認為circRNA有希望作為診斷腫瘤的生物學標志物。Hansen等[30]在人和小鼠腦中發現了高表達的circRNA,證明了circRNA可充當miRNA-7海綿，稱此為miRNA-7的環狀RNA海綿(ciRS-7)。CiRS-7含有70多個選擇性保守的miRNA靶位點，并且以miRNA-7依賴性方式與Argonaute(AGO)蛋白高度相關。盡管circRNA對miRNA介導的靶向去穩定化具有完全抗性，但它強烈抑制miRNA-7活性，導致miRNA-7靶標水平增加。而miRNA-7是包括CRC在內的所有惡性腫瘤中的腫瘤抑制因子，能有效抑制CRC細胞的增殖，且miRNA-7在CRC中可能存在西妥昔單抗耐藥標志物，所以ciRS-7可能會成為CRC中有效的西妥昔單抗耐藥標志物。

五、展 望

綜上所述，非編碼RNA特別是lncRNA、miRNA及circRNA在西妥昔單抗的耐藥機制中起著至關重要的作用，對包括結直腸癌在內的惡性腫瘤的治療具有深遠意義。lncRNA、miRNA及circRNA均可通過介導EGFR信號通路調節西妥昔單抗的敏感度，此外，lncRNA還可通過調節糖代謝及Wnt信號通路導致西妥昔單抗耐藥。隨著生物信息學技術的發展，會有越來越多的與結直腸癌中西妥昔單抗耐藥相關的新非編碼RNA被發現。目前對非編碼RNA的研究也正處于初步階段，其具體調控的機制，需要進一步探索。