間歇低氧相關信號通路研究進展

劉茹悅 劉維英 祁夢雷 閆燕羽

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS)是由于上呼吸道包括鼻、咽部位氣道塌陷引起的以睡眠中打鼾、呼吸暫停等睡眠行為異常，白日疲乏、嗜睡為主要臨床特點的呼吸系統疾病。OSAHS患者睡眠中間歇低氧(intermittent hypoxia，IH)是全身多系統損傷的主要生理病理機制，導致氧化失衡，氧自由基增加，炎癥級聯反應激活促炎性細胞介質的生成，如白介素-2(interleukin-2，IL-2)、IL-4、IL-6、IL-10等炎性細胞因子，以及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、缺氧誘導轉錄因子(hypoxic inducible factor-1，HIF-1)、脂質過氧化物，血管相關內皮黏附分子等[1]。IH致機體損傷的機制中，IH引起的相關信號通路激活在損傷過程中發揮著重要作用。目前普遍認為炎性反應氧化應激是IH致機體損傷的主要原因，對IH相關氧化應激通路的研究也較多，隨著近年來相關研究的深入，發現也可通過細胞凋亡、細胞自噬等信號通路多種途徑引起系統損傷。現就IH與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路、核因子2(nuclea factor erythroid-2-related factor2，Nrf2)/抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)等通路相關性綜述如下。

一、MAPKs信號通路

由MAPK激酶激酶(MAP kinasekinase kinase，MKKK)、MAPK激酶(MAP kinase kinase，MKK)和MAPK組成的MAPK信號通路，分為4個亞族：ERK、p38、JNK和ERK5，相關通路也分別命名為ERK MAPK、p38 MAPK、JNK MAPK及ERK5 MAPK通路。這些通路可被多種細胞因子、激素、神經遞質、細胞氧化應激等激活，激活后參與多種細胞生理病理過程，包括調控細胞生長分化，適應機體外環境刺激，調節細胞炎性反應氧化應激等。

IH致心血管系統損傷主要表現為血管內皮損傷、高血壓、心肌重構、心室肥厚、心肌病等。大鼠IH處理30天后，所有大鼠均發生右心室肥厚，檢測發現HIF-1α表達、p38αMAPK活性增加，同時凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1)、NADPH氧化酶表達上調，通過生成更多的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，增強脂質過氧化致組織結構破壞[2]。IH大鼠也可通過介導內皮素-1(endothelin-1，ET-1)上調頸動脈體p38 MAPK磷酸化水平，使其表達水平升高，IH暴露下頸動脈體可塑性增強，增加繼發性高血壓的發生[3]。ET-1可致頸動脈體化學感受器敏感度增強，進一步促進高血壓的發生，但這種增強過程被p38 MAPK拮抗劑所抑制，提示IH處理后大鼠可通過激活p38 MAPK通路，介導機體高血壓、心肌重構等發生、發展過程，參與心血管系統的損傷。

IH可致多系統損傷，神經系統損傷主要表現為記憶力下降，認知功能障礙。Zhao等[4]研究報道，IH氧化應激后抗氧化物質表達下降及活性降低，進一步觸發MAPKs通路，使下游神經細胞Bcl-2和Bcl-2相關蛋白異常表達，導致海馬神經細胞損傷缺失，說明MAPKs通路激活通過氧化應激失衡參與了多個系統的損傷過程。除了炎癥損傷外，Guan等[5]研究發現，吸入氫氣可以減輕IH大鼠的腎臟病理損傷，除了降低氧化應激反應外，還參與了細胞凋亡和自噬過程，氫氣吸入后主要通過抑制p38、JNK磷酸化過程，防止該通路激活，使凋亡相關因子CHOP、GRP78、caspase-12表達下調，自噬相關蛋白Beclin-1表達升高，p62表達降低，起到保護作用，這一研究結果也證實了IH激活MAPK通路后通過細胞凋亡和細胞自噬作用引起多系統損傷。

信號通路可通過網絡化鏈接互相影響。研究報道IH可通過ERK1/2 MAPK、p38 MAPK和PI3K/Akt信號網絡引起頦舌肌成肌細胞凋亡，導致頦舌肌功能缺陷，影響氣道擴張和開放，抗氧化劑能通過調節這些通路相關因子減輕IH成肌細胞損傷及凋亡[6,7]。說明除了IH動物模型，體外IH細胞研究也通過p38 MAPK通路加重細胞凋亡，降低細胞活力及增殖能力，損傷細胞功能，抗氧化劑的應用，降低內質網應激誘導和細胞凋亡，同時下調炎性介質的表達，恢復細胞活力，明顯改善細胞功能障礙，但目前IH通過多信號通路網絡損傷的機制研究并不多見。

二、NF-κB通路

NF-κB存在于多種動物細胞中，參與機體對外界刺激、調節細胞反應，可被IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、趨化因子、一氧化碳合酶(nitric oxide synthase，NOS)、黏附分子、集落刺激因子、TNF-α等多種物質激活。此外，血紅素加氧酶-1 (heme oxygenase，HO-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等抗炎分子在機體發揮抗炎性反應、免疫應答等過程中對抑制NF-κB通路活化起到重要作用。

有研究通過建立小鼠IH模型，檢測主動脈中TLR4、NF-κB、p65及血清TNF-α、IL-6的表達，發現IH暴露可以促進TLR4的表達，激活NF-κB，增強炎性反應，加重小鼠動脈粥樣硬化斑塊的不穩定性；干預TLR4基因表達后的小鼠動脈粥樣硬化病變減少，斑塊面積較小，斑塊不穩定性降低，體內炎性介質下調，血脂異常降低[8]。TLR4是NF-κB的上游基因，該研究證實了IH通過觸發TLR4/NF-κB信號通路來促進動脈粥樣硬化的進展。通過構建不同氧濃度的缺氧大鼠模型，檢測各組大鼠肺組織中TLR4表達水平，發現隨著缺氧程度加深，TLR4呈升梯度表達，并且隨缺氧程度增加肺泡的損傷破壞程度加重[9]。TLR4的表達與缺氧程度呈正相關，通過TLR4/NF-κB通路誘導炎性細胞因子及趨化因子表達，觸發一系列的肺部損傷，再次證實了IH下NF-κB通路通過炎癥氧化應激參與了機體的多系統損傷。此外，越來越多的證據顯示，OSAHS已成為代謝性疾病的獨立危險因素。IH激活的TLR4/NF-κB信號通路在核苷酸結合結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat protein 3，NLRP3)信號通路協同作用下，下游IL-1、IL-6和TNF-α表達上調，這些因子作用于脂肪細胞受體，使胰島素信號轉導受阻，導致胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和2型糖尿病；并且應用TLR4抑制劑或使NLRP3丟失或下調，可以減輕下游的促炎性反應，對代謝疾病有一定的預防和保護作用[10]。說明IH刺激下TLR4/NF-κB信號通路的促炎作用可能是OSAHS導致代謝性疾病的機制之一。

IH通過激活NF-κB通路加重機體各系統損傷，得到了大量研究結果的證實。但是，有一些研究表現出不同的結果。萬雅琦等[11]用IH預處理7天的大鼠模型行大腦中動脈栓塞處理，相較于對照組大鼠殘存神經元增多，梗死面積減小，TLR4及NF-κB表達下調，提示IH預處理后可能通過抑制NF-κB通路活化減輕神經系統損傷，起到了一定的保護作用。這種結果可能與該研究使用IH的同時采用類似于高海拔地區缺氧的低氣壓(53.5kPa)，IH低氧處理過程中氧濃度較高(最低12%)，IH暴露時間較短均可能與這種正向的保護結果相關。Yang等[12]在誘導大鼠再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)實驗模型中，同樣也給予IH低氣壓(約70kPa)每天5h預處理28天后，再給予誘導AA，炎癥應激反應較對照組減輕，NF-κB及HIF-1的表達較對照組降低，血管細胞黏附因子(vascular cell adhesion molecule，VCAM-1)及晚期抗原4(very late antigen，VLA-4)表達較對照組升高，促進骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC)分泌因子升高，提高骨髓能力，降低AA的發生率。眾所周知，缺氧可以刺激紅細胞的生成，促進造血干細胞和BMMSC的增殖，提前的短期IH低氣壓干預，刺激機體分泌應激因子，機體處于代償狀態，對缺氧存在一定的耐受性，后續再給予缺氧刺激時機體的相關信號通路及炎性因子表達較低，從而在一定程度上起到對機體的保護作用，但這種保護作用是適度的，若長期暴露于IH環境，缺氧程度加深，最終導致機體的損傷。

三、PI3K/Akt信號通路

PI3K/Akt通路在調控細胞增殖、分化、凋亡、葡萄糖轉運等細胞功能方面發揮重要作用，一般情況下，PI3K可被多種因子激活，如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、胰島素等，激活后產生第二信使三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5 trisphosphate，PIP3)，PIP3參與Akt磷酸化激活過程，激活后的Akt可再通過磷酸化反應作用于下游的靶蛋白，如Bad、HIF-1α、NOS、caspase-9等，進一步介導與之相關的生物學效應。

有研究表明，IH干預下的小鼠miR-218表達上調后，參與正向調控PI3K/Akt通路，使下游HIF-1α和VEGF表達增加，增加小鼠主動脈內皮細胞炎癥損傷的同時加重內皮細胞凋亡，同樣的，應用miR-218抑制劑使其表達下調后，HIF-1α、VEGF及凋亡相關因子表達下降，減輕IH下內皮細胞損傷[13]。證明了PI3K/Akt通路參與了IH誘導的血管內皮炎性反應及內皮細胞凋亡過程。另有研究給予抗氧化劑干預，發現其可減輕對體外缺氧/復氧心肌細胞的損傷，抑制線粒體介導的心肌細胞凋亡，提高細胞活力，減輕細胞損傷，并且這種保護作用可以被PI3K/Akt通路抑制劑所逆轉[14]。這些結果都再次證實了IH暴露通過活化PI3K/Akt通路參與氧化應激和細胞凋亡途徑實現對機體的損傷作用。Guan 等[15]研究發現IH后心肌細胞的凋亡指數、氧化標志物及自噬標志物Beclin-1的表達與PI3K/Akt/mTOR信號通路的調控相關，通過PI3K/Akt/mTOR過度激活增加心臟氧化應激、促進心肌細胞凋亡及損害心肌細胞自噬，導致心肌肥厚和功能障礙。miR-17-5p可通過負向調控IH暴露后PI3K/Akt/mTOR信號通路活化，抑制該通路蛋白及下游炎性因子和抗凋亡因子表達，減輕PI3K/Akt/mTOR通路激活細胞凋亡所致的損傷。這些研究結果都正面或側面證實了IH下PI3K/Akt/mTOR通路參與多種途徑介導的系統損傷。

但是，值得強調的是，在公認的IH可通過各種途徑導致多系統損傷的前提下，與上文NF-κB通路類似，有研究者通過檢測心肌細胞凋亡指數及Akt、NOS蛋白，發現大鼠每天在接受低氧濃度6%～8%環境下暴露約2h，14天的短期干預后，再構造急性心肌缺血/再灌注損傷模型， IH干預組大鼠較對照組凋亡指數降低，磷酸化Akt蛋白、磷酸化NOS蛋白表達升高[16]。提示短期的IH干預下，急性心肌缺血/再灌注損傷機體可通過PI3K/Akt/NOS通路抑制心肌細胞凋亡和炎癥應激反應來減輕機體的損傷，可能與短期缺氧適應性調節，下游抗炎性細胞因子表達升高有關。

四、Keap1/Nrf2/ARE信號通路

Keap1/Nrf2/ARE通路是機體抗炎癥氧化應激損傷的關鍵性保護通路，其中Nrf2是細胞調節抗氧化應激反應的關鍵因子，在Keap1的調控下，Nrf2與ARE結合后，激活下游基因包括HO-1、谷胱甘肽硫基轉移酶(glutathione S-transferase，GST)、醌氧化還原酶1(quinine oxidoreductasel，NQO1)等的轉錄程序，影響下游過氧化氫酶(catalase，CAT)、SOD、谷胱甘肽(glutathione，GSH)等抗氧化物質的表達。

金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是Nrf2通路上的靶基因，接受Nrf2的調控，實驗干預MT基因，發現MT基因敲除的小鼠，長期IH后肺損傷更為顯著；Nrf2誘導劑應用后增強Nrf2表達的同時增加下游MT含量，IH所致肺部一系列損傷也較對照組減輕[17]。除了針對Nrf2通路上具體MT基因靶點的調控，IH大鼠直接給予抗氧化劑也可以減輕肺組織損傷，這一過程與Nrf2/HO1通路相關[18]。除肺損傷外，心臟過表達Nrf2蛋白和敲除Nrf2基因的小鼠分別對IH引起的心肌病存在高抵抗性和高易感性。推測Nrf2可作為上游介質，上調抗氧化靶基因MT，通過對下游抗氧化物質NQO-1、SOD等正向調控，來拮抗IH引起的心臟損傷。另有研究表明，小鼠暴露于IH環境中，通過計算胰島β細胞功能指數及測定血清中炎性因子的表達，發現炎癥氧化應激是IH小鼠胰島功能損傷的機制之一，但Keap1/Nrf2信號通路及其下游所調控的抗氧化蛋白在抑制胰腺組織損傷過程中發揮重要作用[19]。這些研究成果都進一步說明了Nrf2通路以保護機制參與IH相關多系統靶器官損害病理過程。

除了大鼠IH模型研究，在體外細胞缺氧/復氧實驗發現，miR-141可通過介導Keap1/Nrf2信號通路減輕細胞氧化應激，改善細胞活力，抑制細胞凋亡，達到減輕細胞損傷的效果，相對應的使用miR-141抑制劑可加重這種細胞損傷[20]。所以，無論體內IH模型，或體外細胞IH培養，經典的抗氧化信號通路Keap1/Nrf2/ARE都通過減輕應激損傷、抑制細胞凋亡來拮抗IH誘導的損傷。

五、其他通路

除了上述經典的信號通路外，還有一些其他信號通路也參與了IH機體的調控，如Song等[21]將SOD2基因敲除的小鼠暴露于IH環境下，相較于正常IH小鼠，SOD2基因敲除小鼠肺內巨噬細胞浸潤及氧化應激程度更重，肺重構程度更顯著，這與SOD2下調后激活NLRP3炎性小體介導的通路增加氧化應激、誘導線粒體功能障礙參與肺部炎癥損傷和血管重構過程有關。Bcl-2/Beclin-1通路激活后自噬相關蛋白表達升高，通過促進細胞自噬、細胞凋亡途徑參與IH下冠狀動脈內皮細胞的損傷過程[22]。在短期IH聯合低氣壓的預處理下，活化Wnt/β-catenin通路可減少癲癇大鼠神經元丟失及受損，改善大鼠認知功能的作用[23]。但信號通路之間的激活都是復雜交互的，這些通路的研究報道并不多見。

六、展 望

綜上所述，短期的IH干預可能在一定程度上通過缺氧耐受和代償增加對機體起到一定的保護作用，但長期暴露于IH環境終會導致機體的多系統損傷，隨著IH損傷研究越來越深入，研究者發現IH環境下MAPKs通路、NF-κB通路、PI3K/Akt通路、Nrf2/ARE這些經典的信號通路通過調節機體氧化應激反應、細胞凋亡、細胞自噬等多條途徑在IH致多系統損傷過程中發揮作用。除此之外，很多其他信號通路,如NLRP3炎性小體介導的氧化應激通路、Bcl-2/Beclin-1介導的自噬相關通路、活化的Wnt/β-catenin通路等也在IH損傷中發揮重要作用。雖然體外動物實驗顯示干預單純單一信號通路相關靶點可減輕IH的損傷過程，但針對這些信號通路的靶向治療還處于動物實驗階段。因此，通過研究調控信號通路相關靶點可能會成為未來IH疾病防治的關鍵策略之一。同時，多條信號通路間的網絡化交互影響，如ERK MAPK、p38 MAPK和PI3K/Akt的協同信號網絡；TLR4/NF-κB通路和NLRP3通路等通過交互鏈接對機體多系統的協同損傷作用，為IH下通過調控機體多條信號通路來延緩多系統損傷提供新思路，相信隨著醫學研究的進步與發展，相關信號通路靶點調控在IH疾病的治療或延緩過程中一定會擁有廣泛的應用前景。