三維細胞培養在膀胱癌中的研究進展

張 濤 張開能 柯昌興

2020年全球膀胱癌新發人數超過57萬，約占新發腫瘤人數的3.0%，死亡人數超過21萬，占比為2.1%[1]。淋巴轉移是膀胱癌最常見的轉移途徑，且最常轉移至盆腔淋巴結。合并淋巴結轉移時，患者5年生存率可明顯減低至25%～35%[2]。患者接受手術治療可在一定程度改善預后，但患者術后5年生存率仍較低，細胞培養在了解膀胱癌的發生、發展機制中發揮著重要的作用，其中三維細胞培養能較好地模擬腫瘤細胞生長的真實情況。

一、三維細胞培養與腫瘤

細胞培養是藥物發現、腫瘤研究及干細胞研究中重要且必要的過程，該技術在研究腫瘤生物學行為和分子調控行為中具有重要的作用[3]。既往研究表明，二維細胞培養模式是培養細胞的主要方法，在研究中起著至關重要的作用，但由于二維細胞培養模式在體外不能準確地代表組織細胞及不能較好地模擬腫瘤微環境，存在較多的局限性[4]。三維細胞培養在更好地模擬并復制體內細胞生物學中展示出獨特的優勢(如增加腫瘤細胞和微環境之間的相互作用)。近年來，三維細胞培養發展迅猛，其關鍵目標之一是再現人體細胞的空間組織結構和功能。在進行三維細胞培養時，可以對細胞環境進行調控，從而模擬體內的細胞環境。與此同時，三維培養能很好地模擬腫瘤細胞生長的真實情況，對于研究腫瘤微環境、腫瘤細胞生物學行為及抗腫瘤藥物篩選等方面具有重要意義[5,6]。因此，三維細胞培養有望最終彌補二維細胞培養模型與動物模型之間的差距。

二、三維細胞培養與膀胱癌腫瘤微環境

從膀胱癌發生到開始轉移的過程中，腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)起著至關重要的作用，TME由腫瘤細胞與周圍環境基質成分之間密切的相互作用形成，復雜多變，其復雜性在于腫瘤和基質細胞之間的相互作用，而兩者間的相互作用可通過各種機制參與膀胱癌的發生、發展和免疫抑制等過程[7,8]。然而，在開發體外模型時，典型腫瘤微環境的成分往往被忽視。腫瘤微環境的細胞(如巨噬細胞、內皮細胞或與癌癥相關的成纖維細胞等)參與腫瘤細胞的增殖和遷移，其中炎性細胞通過多因素協同作用形成了TME中免疫調節的特有方式，使得腫瘤細胞能逃逸免疫監視，進而發生轉移。常規的二維細胞模型受限于單層形態，無法重現體內腫瘤細胞的特性及復雜的腫瘤微環境，并且細胞與細胞及細胞外基質之間的信號傳遞大大衰減，導致無法提供確切有效的信號信息[9,10]。

非細胞成分包括細胞外基質(如膠原蛋白是細胞外基質的重要組成部分，并以多種形式存在)和各種細胞因子(如生長因子、干擾素、腫瘤壞死因子等)，在腫瘤血管的生成、細胞增殖、遠處轉移等方面也起著重要的作用。通過建立體外膀胱癌研究模型，可用于觀察其發生、發展、轉移及耐藥機制，為膀胱癌的治療找到新的治療方法及靶點。與此同時，三維培養系統還可與多種基質和細胞成分結合，許多不同類型的細胞(如腫瘤相關的巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞及淋巴細胞等)可以整合在三維培養模型中，產生的共培養能夠進一步闡明腫瘤細胞與其他類型細胞及細胞外基質之間的信號傳遞。因此建立三維細胞共培養模型是研究TME的有效手段，其較好地模擬了體內腫瘤細胞生長的微環境，能更好地模擬體內腫瘤細胞生物學行為。研究表明，三維細胞培養能夠更好地再現膀胱癌發生浸潤的微環境，從非侵襲性腫瘤發展為侵襲性腫瘤的過程中，膀胱癌細胞必須穿透基膜并穿過Ⅰ型膠原蛋白。Ⅰ型膠原蛋白現已被用作構建三維細胞模型的常用基質，其模擬細胞外基質的效果優于二維培養，并且膀胱癌細胞在三維培養中細胞排列更加緊密和自然，因此三維細胞培養能更好地模擬膀胱癌細胞在體內的腫瘤微環境，對于研究膀胱癌的發病機制具有重要作用[11]。

三、三維細胞培養與膀胱癌生物學行為

膀胱癌的發生、發展和侵襲轉移受多因素影響，是一個復雜的病理生理過程。相關研究進一步揭示了在三維培養條件下，除了膀胱癌的血管生成能力增強外，其侵襲、遷徙和增殖能力均有增強[12]。三維培養條件下膀胱癌T24細胞的侵襲能力較二維細胞培養明顯增強，其主要原因可能是因為在三維培養條件中Eph A2、MMPs及E-cadherin的表達上調，提高了其黏附和侵襲的能力[13]。腫瘤的能量代謝與腫瘤的發生、發展密不可分，在膀胱腫瘤的三維培養技術中，其線粒體能量代謝增強[14]。膀胱腫瘤細胞的能量代謝并不完全符合“Warburg效應”，即使在充足的氧氣條件下，仍會發生糖酵解(膀胱癌細胞具有有效的氧化磷酸化過程，可促進相鄰間質細胞中的糖酵解)，導致營養前體增加，這些高能代謝產物沿指定方向轉移到相鄰的腫瘤細胞中，并進入三羧酸循環，最終氧化磷酸化增加，產生足夠的ATP以滿足需要。Kim等[15]利用三維生物打印機制作了膀胱癌細胞的三維支架，比較膀胱癌細胞分別在三維和二維培養條件中的存活情況，結果顯示，三維培養能更為準確地模擬癌細胞在體內增殖的情況，且增殖程度高于二維。三維細胞培養模型還能顯示出與細胞間的相互作用，且與體內環境中各細胞間相互作用相似。因此，三維細胞培養能更好地知曉膀胱癌細胞的生物學行為。

四、三維細胞培養與抗膀胱癌藥物篩選

藥物是治療腫瘤的重要手段之一。抗癌藥物篩選始于二維細胞培養，二維細胞培養測試成功后轉向動物模型測試和臨床試驗，約 90% 在二維細胞模型中被證明有效的藥物，在臨床試驗中失敗，僅約10%通過二維細胞培養測試的藥物可成功用于臨床研發和加工，所以二維細胞培養在篩選抗癌藥物中造成巨額研發資金的損失[7,16]。二維培養條件下組織結構和細胞間的相互作用缺失，不能真實地反映體內的情況，而三維細胞培養能模仿細胞的真實生長狀態，基因表達更接近體內，被認為更適用于藥物篩選[17～20]。

卡介苗是目前治療膀胱癌患者常用藥物之一，大約30%～50%接受卡介苗治療的患者在治療的前5年內沒有反應，且不良反應明顯，使其在臨床中的應用受到限制[21]。而卡介苗卻在二維細胞培養模型中顯示出很好的療效，與實際臨床結果并不相符。Kim等[15]研究認為，在比較兩種細胞培養方式對于藥物的作用時，應首先確認分泌抗腫瘤細胞因子(IL-6、IL-12及IFN-γ等)的總量，因其能直接影響抗腫瘤作用；在使用卡介苗處理時，二維模型中分泌了更多的抗腫瘤細胞因子，從而增加了在治療膀胱腫瘤中的抗腫瘤作用，導致二維模型在抗腫瘤作用中的效果被夸大。相反，越來越多的研究表明，三維細胞模型相較于二維細胞模型顯示出更高的耐藥性，能更加真實地反映患者體內對抗腫瘤藥物的特性，進一步說明三維細胞培養更適合于體內模型[22]。

上皮-間充質轉化是上皮細胞失去細胞間相互作用而變為活動性和侵襲性的過程，細胞間相互作用可能導致細胞系生長和藥物作用之間的差異，上皮-間充質轉化過程中表達的鈣黏蛋白存在于細胞膜中，當存在兩個不同細胞的細胞膜中的鈣黏蛋白結合時，就會誘導細胞間的相互作用。E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白是細胞間相互作用的關鍵標志，E-鈣黏蛋白在細胞黏附中起著重要作用，并且在細胞與細胞之間的相互作用中表達最多，N-鈣黏蛋白在細胞解離和轉移時表達，三維模型中兩種鈣黏蛋白明顯高于二維模型[23]。

轉化生長因子-β1是誘導上皮-間充質轉化并促進癌癥的重要因素，轉化生長因子-β1分別處理三維細胞培養和二維細胞培養模型，在二維細胞培養模型中，轉化生長因子-β1處理前后E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白之間的差異并不顯著。然而，由于強大的細胞間相互作用，在三維細胞培養模型中，轉化生長因子-β1處理后的每種鈣黏蛋白的含量均存在差異，所以藥物的敏感度可因細胞與細胞間的相互作用而發生改變，從而導致藥物的滲透性和有效性存在一定差異[15]。因此，構成細胞間相互作用機制的三維細胞模型可能會提供更好的藥物測試平臺，而且，與二維細胞培養模型評估藥物反應所獲得的結果相比，三維模型的使用可以獲得更準確的結果[24]。此外，三維培養模型還可通過整合人體提供的組織，構建整體器官系統進一步研究，更加準確地預測個人對藥物的特殊反應，從而開發個性化藥物，改善癌癥和其他疾病的治療。

五、展 望

三維細胞培養方法正處于突破性發展的邊緣，與二維細胞培養比較有許多優勢，能更好地模擬腫瘤微環境、腫瘤細胞的生物學行為和藥物處理時的信號變化情況。但三維細胞培養所用成本較高，且并非所有情況下均能有效地復制細胞微環境，如多數三維細胞培養模型缺少基膜，而基膜是分隔上皮細胞和基質的物理屏障，腫瘤侵襲時會影響腫瘤細胞與基膜之間的動態相互作用，使基膜降解及腫瘤細胞從上皮層遷移，因此，當需要以基膜研究原發性腫瘤的遷移情況時，運用三維細胞培養復制微環境較困難。但隨著相關技術的迅猛發展，有望開發出新的方法來克服三維細胞培養目前面臨的限制，同時降低其使用成本，從而得到更為廣泛的應用，為廣大腫瘤患者帶來福音。