多發性骨髓瘤有氧糖酵解的研究進展

楊夏影 馬銀娟 師麗麗 吉小凡 潘耀柱

多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種漿細胞惡性克隆增殖性疾病，是臨床上常見的全身性血液系統疾病之一，僅次于淋巴瘤，多發于老年，目前仍無法治愈[1]。復發或難治性MM患者中位總生存期僅有8個月[2]。常見的癥狀包括骨髓瘤相關器官功能損傷的表現，即“CRAB”癥狀[血鈣增高(calcium elevation)、腎功能損害(renal impairment)、貧血(anemia)、骨病(bone disease)]以及繼發淀粉樣變性等[1]。因此尋求新的治療策略迫在眉睫。目前以18F-FDG作為標準核醫學成像方式的PET/CT越來越多地應用于MM的早期診斷、療效評估、預后判斷以及LDH在修訂的國際分期系統(R-ISS)中被視為影響預后的獨立危險因素[1,3]。相信糖酵解酶與MM的發生、發展有著千絲萬縷的聯系。故本文就有氧糖酵解在MM中的研究進展進行綜述如下。

一、有氧糖酵解途徑

1924年，德國生物化學家Otto Heinrich Warburg研究發現，肝癌細胞的糖酵解較正常肝細胞活躍，并首次提出在氧氣充足條件下，惡性腫瘤細胞糖酵解同樣活躍的觀點。這種有氧糖酵解的代謝特征被稱為瓦博格(Warburg)效應。正常細胞在有氧條件下通過氧化磷酸化代謝葡萄糖，1mol葡萄糖徹底氧化凈生成30mol或32mol ATP，而通過糖酵解途徑最終只能生成2mol ATP。糖酵解是一種低產能的代謝模式，為何腫瘤細胞卻如此偏愛后者？研究發現，代謝最終產物乳酸形成的酸性微環境有利于腫瘤細胞的迅速生長及遠處轉移；用于滿足惡性增殖的生物大分子可以通過糖酵解中間代謝產物進行合成；抑制了線粒體功能可使活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成減少，從而減輕ROS的細胞毒性以抵抗凋亡[4]。那么，葡萄糖是如何進入細胞代謝并生成乳酸及ATP的呢？首先，葡萄糖進入細胞是在葡萄糖轉運蛋白(glucose transporters，GLUTs)的輔助下實現的；其次，在己糖激酶(hexokinase，HKs)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，PFKs)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PKs)等關鍵酶調控下促進丙酮酸生成并逐步釋放能量，最終生成的丙酮酸經三羧酸循環途徑代謝或者由乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase, LDHs)催化生成乳酸。在此過程中，由限速酶參與的不可逆反應起了重要的調節作用。

二、葡萄糖轉運蛋白與MM

葡萄糖吸收入血后首先進入細胞，這是依賴GLUTs實現的。GLUTs由13個成員、3個亞類組成，包括作為葡萄糖轉運體的GLUTs：GLUT1、GLUT2、GLUT3、GLUT4；作為果糖轉運體的GLUTs：GLUT5、GLUT7、GLUT9、GLUT11；結構不典型且迄今定義不明確的GLUTs：GLUT6、GLUT8、GLUT10、GLUT12和肌醇轉運蛋白(HMITL1)。有研究證實，與非惡性腫瘤組織比較，GLUT1、GLUT3、GLUT4、GLUT6在惡性腫瘤中表達上調，如子宮內膜癌、乳腺癌等[5]。在營養缺乏的癌細胞中，Akt信號增加可過度表達GLUT1，PI3K/Akt信號通過GLUT1膜定位調節葡萄糖攝取增加糖酵解速率，由此對抗細胞凋亡。GLUT1的表達也因缺氧誘導因子(HIFs)的增加而增加。Matsumoto等[6]研究發現，一些骨髓瘤細胞系如NCI-H929和RPMI8226細胞通過GLUT1結合葡萄糖，與正常細胞比較增加了葡萄糖攝取能力。應用GLUT1特異性抑制劑STF-31后發現，GLUT1高表達的骨髓瘤細胞死亡，而對GLUT1低表達細胞，如來自健康供體的外周血單個核細胞(PBMC)沒有顯示毒性作用。這一結果表明，STF-31誘導的細胞凋亡與細胞內葡萄糖缺失相關且與GLUT1的表達水平呈正相關。同時協同STF-31增強了美法侖(Mel)、阿霉素和硼替佐米(Bort)誘導的細胞死亡。GLUT4對MM細胞存活也是非常重要的。McBrayer等[7]進行基因表達譜研究，發現MM中失調的GLUTs家族成員，并證明骨髓瘤細胞依賴結構性細胞表面定位的GLUT4來消耗基礎葡萄糖，維持Mcl-1表達、細胞生長和存活。隨后Cao等[8]對MM細胞增殖與GLUT4表達之間的關系進行了研究，通過抑制基因轉錄途徑中關鍵因子PGC-1α降低了GLUT4的表達，抑制了RPMI8226細胞的增殖。由此可知，不同或相同的骨髓瘤細胞可能表達不同的GLUTs，故在應用GLUTs靶向治療時應評估負責腫瘤細胞葡萄糖攝取的轉運體。

三、糖酵解關鍵酶與MM

1.己糖激酶(HKs)：葡萄糖進入細胞后發生磷酸化反應，生成葡糖-6-磷酸(G-6-P)，該反應不可逆，是糖酵解的第1個限速步驟，由HKs催化，Mg2+參與。HKs已知有5種不同的類型，是由不同染色體的不同基因控制。在哺乳動物中分別為HK1、HK2、HK3、HK4、HK5，又稱己糖激酶結構域蛋白1(HKDC1)，HK1和HKDC1基因首尾相連排列，顯示它們是通過串聯基因復制而形成的產物。研究發現，HK2在多種實體瘤中高表達，如肺癌、胰腺癌、肝癌等。在哺乳動物正常細胞中低表達，也是HK2抑制劑臨床應用的基礎。HK2不僅可促進葡萄糖發生磷酸化反應，在MM細胞中，高表達HK2與線粒體外膜中的電壓依賴性陰離子通道(VDAC)相互作用，并驅動糖酵解途徑。細胞周期蛋白D1與HIF1α結合在基因轉錄水平上控制了HK2的表達并通過增強糖酵解途徑及新生血管的形成，導致MM細胞具有抗凋亡表型[9]。除此之外，Ikeda等[10]研究發現，在MM細胞中，缺氧誘導HK2的高表達，并通過HK2-mTORC1途徑調節細胞自噬功能由此對抗細胞凋亡。因此靶向HK2具有重要的臨床意義。

研究發現，HK2抑制劑3-溴代丙酮酸(3-BrPA)可導致骨髓瘤細胞內ATP嚴重耗竭及抑制藥物流出轉運蛋白，具有顯著的抗腫瘤作用。與Bort協同增強了促細胞凋亡作用；與Bort聯合增強了后者在耐藥患者中的促細胞凋亡作用，單用也具有同樣效應。研究還發現，HK2抑制劑非諾貝特、葡萄糖類似物2-脫氧葡萄糖(2-DG)等均具有顯著的抗腫瘤作用并應用于治療舌腫瘤及晚期肺癌、乳腺癌的臨床實驗中[11]。除3-BrPA外，希望有更多安全的HK2抑制劑應用于MM臨床實驗中。此外，HK2的表達與MM預后具有顯著相關性。Caillot等[9]通過數據分析發現HK2高表達，MM患者的無事件生存期(EFS)和總生存期(OS)明顯縮短。Abe等[12]對90例初診的MM患者進行分析并首次發現低表達HK2相關的假陰性PET/CT與患者較好預后具有相關性。

2.磷酸果糖激酶(PFKs)：PFKs又稱6-磷酸果糖激酶-1(PFK-1)是糖酵解的第2個關鍵酶，催化果糖-6-磷酸轉變為果糖-1,6二磷酸(F-1,6-BP)，該反應不可逆，是糖酵解的第2個限速步驟。在人類中有3種亞型：PFKL(肝臟型)、PFKM(肌肉型)和PFKP(血小板型)。PFK-1的動力學和調控特性是由細胞內不同亞基的類型和比例所決定的。PFK-1活性受細胞內中間代謝產物調節，如ATP、ADP、果糖-6-磷酸和果糖-2,6-雙磷酸(F-2,6-BP)。與正常細胞比較，來自大鼠甲狀腺癌、人白血病及膠質瘤的PFK-1受F-2,6-BP的激活更敏感。PFKFB-PFK-2/果糖二磷酸酶-2，是負責F-2,6-BP合成和降解的雙功能酶。PFKFB3普遍表達且具有較高的激酶活性，其通過促進F-2,6-BP的合成，間接影響PFK-1的表達是調控糖酵解速率至關重要的方式。

Liu等[13]在人MM細胞系RPMI8226、ARP-1、OPM2及健康志愿者的PBMC中發現，與對照組比較，PFKFB3在MM細胞系中的表達更高，通過抑制PFKFB3，降低了細胞內F-2,6-BP水平，從而抑制葡萄糖攝取并加速MM細胞的凋亡。3PO作為PFKFB3的小分子拮抗劑可部分和短暫減少糖酵解,且對正常組織無嚴重毒性作用。PFK15作為3PO衍生物，具有更高的選擇性，抑制效果增加了約100倍，與二甲雙胍聯合具有協同抗骨髓瘤作用。PFK158是一種新型PFKFB3抑制劑并在實體瘤中進行Ⅰ期臨床試驗(NCT02044861)，目前尚未報道出嚴重的不良事件，有望用于多發性骨髓瘤的治療[14]。此外，研究發現，在乳腺癌中存在PFK-1類型轉換，即從PFKL到PFKP是糖酵解程度增強主要因素[15]。在急性髓性白血病中發現PFKL水平可顯著升高。Ganapathy-Kanniappan等[16]應用臨床樣本以及實驗模型發現肺癌中的PFKP表達與OS相關，PFKP的下調具有顯著抗癌效應。那么，骨髓瘤中是否也存在類型轉換及關鍵酶作用如何仍有待進一步研究。靶向PFK-1在骨髓瘤治療方面具有廣闊前景，未來也有望成為疾病監測的重要指標。

3.丙酮酸激酶(PKs)：PKs是糖酵解的第3個限速酶，作用于有氧糖酵解途徑的倒數第2步，催化磷酸烯醇式丙酮酸轉變為丙酮酸，此反應不可逆。PKs包括4種同工酶：PKL型(肝臟型)、PKR型(紅細胞型)、PKM型(肌肉型)，M型又分為M1型(PKM1)和M2型(PKM2)。PKM1和PKM2是由PKM基因經不同剪接方式編碼而生成的產物。PKM2低活性的二聚體形式有助于癌細胞增殖所需物質積累；高活性的四聚體形式具有很強的催化活性，導致ATP合成和分解代謝。PKM2主要分布在快速增殖的胚胎組織和腫瘤細胞，在細胞質及細胞核中均有分布。先前有研究報道PKM2主要在細胞核中發揮作用，主要與細胞增殖相關。然而，He等[17]利用PKM2 siRNA轉染RPMI8226細胞后發現，PKM2表達降低，細胞周期阻滯，生長速率明顯受抑。利用PKM2 siRNA干擾RPMI8226和U266細胞，PKM2下調提高了細胞的黏附率，黏附狀態下的MM細胞 PKM2核聚集，且對Bort、Mel和米托蒽醌(Mito)的敏感度低于懸浮細胞，從而證實了通過沉默PKM2提高了細胞黏附率并促進耐藥性的產生，其可能通過核PKM2發揮藥物抵抗作用。

目前PKM2在MM中的研究尚不充分，具體作用機制有待于進一步探索。在MM中,為適應其增殖和代謝需要，也存在PKM1向PKM2亞型的轉變。Gu等[18]在NEK2過表達的人骨髓瘤細胞ARP1、OPM2中研究發現，NEK2通過與異質性胞核核糖核蛋白(hnRNP)A1/2的相互作用調控了MM細胞PKM未成熟RNA的選擇性剪接，上調了PKM2的表達，增加了PKM2/PKM1的比值，促進了有氧糖酵解，促進了細胞增殖并增強了其致癌活性。同時對351例新診斷的MM患者進行了EFS和OS的Kaplan-Meier分析顯示，高NEK2、PKM2組的EFS和OS明顯縮短。由此而知，PKM2與MM的發生、發展關系密切。靶向PKM2在治療MM中有望成為有效的治療措施，還需更多的基礎和臨床研究來探索。

4.乳酸脫氫酶與MM：LDHs是乳酸生成的關鍵酶也是細胞有氧糖酵解的關鍵限速酶之一。LDH是一類煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性激酶，由LDHA、LDHB、LDHC 3種亞基組成。哺乳動物LDH是由4個亞基組成的四聚體，常見的A、B兩種亞基構成的5種同工酶，即LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。對不同的底物有不同的反應性。而C亞基則僅組成一種LDH同工酶即LDH-C4(特異性存在于哺乳動物生殖細胞)。LDH主要存在于細胞內，當細胞受損時，就會被釋放入血，導致血清LDH水平增高。LDH通常在造血系統惡性腫瘤患者中升高明顯，如霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)或MM。其中LDHA與癌癥的發生、發展具有高度相關性。

與正常細胞比較，在MM細胞中，LDHA過表達導致細胞具有以糖酵解為主的新陳代謝，其通過增強LDH酶的活性、乳酸的產生，從而促進細胞增殖，且與氧氣供應無關，PGC1β在此過程中起到了正性調控作用[19]。此外，LDHA的表達還受miR-489影響。研究發現，高表達miR-489通過下調LDHA，具有抑制葡萄糖攝取、乳酸分泌和ATP產生的作用，從而抑制有氧糖酵解并導致MM細胞增殖減少[20]。在腫瘤免疫中，乳酸生成能夠調節腫瘤細胞微環境(TEM)并通過阻止下游通路間接抑制腫瘤細胞的免疫應答，抑制機體免疫功能，從而幫助細胞發生免疫逃逸。同時酸性TEM的形成，有助于腫瘤細胞的增殖和轉移[21]。因此，靶向LDHA是抑制腫瘤細胞轉移，延緩疾病進展的基礎。草氨酸鹽、棉酚、棉酚衍生物-FX11、陪黃素等是目前公認的LDHA抑制劑，在乳腺癌、肝癌、非小細胞肺癌等多種腫瘤細胞中具有很好的抗腫瘤作用，但由于缺乏特異性、作用較弱、不良反應多且具有明顯的毒性不良反應等特點限制了其在臨床的應用[22]。在同樣高表達的MM中這些藥物是否有效且不影響周圍正常組織有待于進一步研究。

四、展 望

MM不僅是基因病也是能量代謝異常性疾病。現有研究發現，在MM中葡萄糖轉運蛋白GLUT、糖酵解關鍵酶——HK、PFK、PK及乳酸生成關鍵酶LDH在腫瘤細胞能量代謝過程中發揮了重要作用。當前復發難治性成為嚴重影響MM患者生存質量及預后的關鍵因素。由于此類患者缺乏標準化治療方案，個體化治療又顯得尤為重要。如何及時有效掌握病人的病情變化，選擇合適的治療方案是目前急需解決的問題。GLUT、HK、PFK、PK與MM的發生、發展關系密切，未來有望成為臨床診治MM的重要生物學標志物并用于指導臨床。