海南粗榧研究進展

林玲，黃川騰，陳飛飛，董曉娜

海南省林業科學研究院（海南省紅樹林研究院），海南海口571100

海南粗榧（Cephalotaxus manniiHook.f.），為三尖杉科，三尖杉屬喬木植物，已被列入中國植物紅皮書中，并確立為國家I級重點保護植物[1]。目前從海南粗榧中已分離并鑒定出生物堿50種[2]，其主要成分三尖杉酯堿類對治療白血病和急性淋巴病有特殊療效，是目前抗癌最有潛力的自然藥源之一，但是由于樹種自身原因和人為破壞與干擾，該樹種瀕臨滅絕[3]。龐曉慧等[4]綜述了海南粗榧的資源學研究及相關的繁殖技術研究。隨著研究的深入，不少的新研究內容和技術相繼報道，該文擬較全面對國內外諸多學者圍繞海南粗榧核形態學、藥用成分、內生真菌、遺傳多樣性、群落學、繁育技術等現階段的研究進展進行了綜述，并提出未來的研究方向，以期為其深入研究和保護利用提供參考。

1 資源學研究

海南粗榧在國內主要分布于海南、廣東、廣西、云南和西藏，在海南又主要分布于尖峰嶺、霸王嶺、鸚哥嶺、吊羅山等自然保護地中[5]。海南的海南粗榧株數和蓄積量均約占全國總量的90%，占粗榧資源絕對優勢[1]，該樹種是海南傳統的優良用材樹種，在商品材采伐時代被列為二類材[6]。

2 種群和群落學研究

海南粗榧多生于海拔700m～1200m的山地雨林中的山地黃壤，在海南常與紅錐（Castanopsis hystrix），母生（Homalium ceylanicum），雞毛松（Dacrycarpus imbricatusvar.patulus）等混生[3]。對海南霸王嶺的海南粗榧群落植被生物多樣性研究結果表明，不同樣方中的喬、灌、草各層的生物多樣性指數出現極顯著差異，但同一樣方中喬木層和灌木草本層生物相差不大，主要優勢種為紅紫麻（Oreocnide rubescens）、野芭蕉（Musa balbisiana）、藥用狗牙花（Tabernaemontana bovina）等[7]。

3 結構解剖學研究

對海南粗榧的葉片結構和莖次韌皮部解剖結果表明，為雙環型氣孔，氣孔密度47.3個/mm2～88.1個/mm2，無皮下層，有些葉肉中具星狀石細胞、短石細胞、纖維狀石細胞，有些完全無，下表面具明顯的角質突起[8-9]，但杜道林等[10]研究表明，海南粗榧葉表面氣孔為12列～15列（多數為14列），氣孔結構為完全或不完全的雙環型氣孔或單環型氣孔，大小變化較大，副衛細胞2個～6個（多數為2個），同時表明環境因子對海南粗榧葉氣孔結構影響差異很大，與土壤質地、厚度、營養狀況、坡度、光照等環境因子關聯度很大[11]。

4 分子生物學

釆用RAPD技術從分子水平分析，結果表明海南粗榧除了與篦子三尖杉的親緣關系較遠，支持將篦子三尖杉獨立成組[12]；喬飛等[13]研究海南粗榧PDS基因和利用NJ法建立系統進化樹，表明海南粗榧PDS是真核的裸子植物，其位置處于單獨一個分支上。

5 遺傳多樣性研究

向志強等[14-15]對吊羅山、卡法嶺、尖峰嶺、霸王嶺、黎母山5個海南粗榧種群開展研究，對海南粗榧種群遺傳多樣性和遺傳分化程度分析結果表明，種群遺傳多樣性水平較低，種群間遺傳分化程度較低，黎母山種群與其它種群分化最大，可能是受到傳粉時盛行的風向影響有關。調查結果表明，5個種群的植株總體形態都未產生分化，而單一性狀上，僅吊羅山種群體現出群體化的趨勢，但分化不明顯；王峻玉等[16]開展以上5個海南粗榧種群染色體水平遺傳多樣性研究，結果表明海南粗榧不同種群核型表現出一定差異，但是差異不顯著，種群內的變異量總是遠遠超過種群間的變異量，5個海南粗榧種群間在常規染色體的遺傳變異中，來自于種群間的變異平均只有10%，約90%變異來自于種群內的個體和細胞間，種群間進行著頻繁的基因交換。

6 海南粗榧藥用研究

6.1 有效藥用成分分離提取

20世紀70年代初至80年代以來，從海南粗榧中分離出17個生物堿和2個內酯[17]，至目前，已從海南粗榧中分離鑒定出50余種生物堿，其主要成分為三尖杉酯類生物堿[2]。三尖杉酯堿、高三尖杉酯堿、異三尖杉酯堿、脫氧三尖杉酯堿、海南粗榧新堿、海南粗榧內酯、紅殼松生物堿（簡稱紅堿）有較強的抗腫瘤活性，已開發成治療多種癌癥的藥物[18-21]；還從海南粗榧乙醇提取物中分離得到3個苯丙素類化合物和2個木脂素類化合物，均具有抗氧化活性[22-23]。

6.2 有效藥用成分合成

6.2.1 懸浮細胞和生物堿的合成研究

海南粗榧現有資源嚴重稀缺，海南粗榧懸浮細胞來促進三尖杉醋類堿的合成，可以有效解決稀有藥用資源的供需矛盾。陳林等[24]使用海南粗榧愈傷組織進行懸浮培養，利用HPLC技術檢測懸浮細胞和培養基中生物堿的含量；陳蕾等[25]利用RACE技術從海南粗榧中克隆出紫杉烷13α-羥化酶基因，合成紫杉醇。龍曉娟等[26]研究表明在海南粗榧懸浮培養第15d分別添加100μmol/L茉莉酸甲酯和50μmol/L水楊酸最有利于三尖杉酯類堿的合成。蔣旋嫻等[27]研究指出L-色氨酸及其衍生物5-MT能抑制代謝支路，促進代謝流向產物三尖杉酯類堿的方向；潘亞華等[28]研究表明海南粗榧細胞固定化培養，抑制了細胞的生長，延長了細胞的生長周期，但縮短了細胞生產三尖杉酯堿的周期。

6.2.2 海南粗榧新堿研究

海南粗榧新堿的研究比較熱門。20世紀80年代初，從海南粗榧的樹皮和三尖杉中分離到海南粗榧新堿，通過單晶衍射以及波譜學，最終確定海南粗榧新堿的結構[29-30]，學者通過動物實驗發現海南粗榧新堿具有邊緣抗腫瘤活性，對白血病有一定療效，但尹大力等[31]卻發現海南粗榧新堿的溶解性較差，動物體內吸收很少。為改善溶解性能及提高活性，發現并篩選了一些具有較好生物活性的衍生物，并通過人工手段，合成較好的抗腫瘤的藥物[32-35]。

6.2.3 內生真菌研究

植物內生真菌是指生活在植物體內或生活史的一定階段處于植物體內的真菌，與宿主形成長期互惠共生關系[36]，許多內生真菌可產生與宿主相同或相似的次生代謝物，具有多種活性，包括抗腫瘤活性[37]。陳蘋等[38]從海南粗榧中分離得到72株內生真菌，其中68株為半知菌類，其對宿主具有一定的組織專一性；蔡坤等[39]從海南粗榧樹皮樣品中分離得到213株內生真菌，它們分屬34個屬，未知屬37株；齊靜等[40]分離獲得416個內生真菌菌株，分屬12個屬，其中10屬為半知菌，2屬為子囊菌；吳延春等[41]從海南粗榧中第一次分離獲得生赤殼屬內生真菌。可見隨著研究不斷深入，分離鑒定出來的內生真菌越來越多。

7 繁育技術研究

7.1 種子育苗技術

王有生等[42]和王獻溥[43]研究報道海南粗榧為雌雄異株，10月～11月種子成熟，樹種結實具有明顯的大小年、結實量少，且休眠期較長。而種子在低溫儲藏80d～100d催芽后，可提高發芽率。曾祥全等[44]研究指出，未經催芽就播種，240d以后才陸續發芽，發芽不整齊，而且發芽率較低。在常溫下濕沙催芽90d左右，播種60d后，種子發芽率約30%；采用濕沙在低溫下層積催芽90d左右，播種60d后，其種子發芽率可提高到72%。莫世琴等[45]5℃～10℃低溫下用濕沙或濕椰糠層積催芽90d，45d后，種子就開始發芽，出芽率可達80%。

7.2 扦插育苗技術

王獻溥等[43]在秋季，以河沙為基質，3年生枝條作插穗，未經任何處理開展扦插試驗，生根率為26.5%；使用激素ABT1000mg/L處理插穗，生根率可達82.5%。而使用激素IBA1000mg/L～1500mg/L處理插穗的效果也較好，插條生根率可達70.0%以上，平均生根數為3.8條～4.0條；椰糠基質扦插效果均好于河沙、沙混土和表土的基質，側枝扦插較直生枝容易生根[46-47]。研究還發現秋季或冬季的扦插效果好與其他季節[48-49]。劉進平等[50]以2000mg/L的萘乙酸（NAA）處理未完全木質化的枝條3h的生根效果最好，成活率在90%以上，完全不處理則不能生根成活；黃桂華等[48]研究則以甘蔗渣和表土按1：1混合攪拌為基質，以1500mg/L的激素IBA濃度為生根劑處理插穗，生根率最高，可達到84.89%；陳飛飛等[49]選取0.5年生～1年生健壯枝條，剪成長度8cm～10cm的插穗，以2000mg/L的ABT溶液蘸藥3min處理，河沙、椰糠、紅土等比例配制成的混合基質，扦插生根效果較好，生根率最高可達80.67%。

7.3 組織育苗技術

選用海南粗榧的莖尖、芽、莖段、幼苗根段的離體組織進行組培，能誘導出愈傷組織，但未能進行離體繁殖[43，51]。而李志英等[52]采用海南粗榧的莖段進行組織培養，小苗最高成活率達80%左右。外植體滅菌和愈傷組織褐變是影響組織培養成果的兩大因素，針對這兩大難題，劉進平等[53]選用海南粗榧溫室扦插苗的嫩莖段外植體滅菌和愈傷組織誘導開展實驗，篩選出MS+0.5mg/LNAA+0.5～1.0mg/LBA+2.5～4.0mg/L2，4～D培養基，以70%酒精表面消毒處理1min后，以0.1%氯化汞溶液消毒12min，誘導愈傷組織效果最好；王成韜等[54]探討不同滅菌方法對海南粗榧外植體污染和細胞活性的影響，結果表明，以75%酒精滅菌1min、臭氧滅菌30min，再用0.1%HgCl2溶液滅菌10min的滅菌方法最佳，其外植體污染率5%，愈傷組織誘導率95%，外植體細胞活力比對照提高38%。王成韜等[55]研究發現葉片外植體誘導產生的愈傷組織褐變率較莖段外植體低，抗褐變劑和激素的合理配比能有效地抑制愈傷組織培養中的褐變，促進其生長。

8 研究展望

海南粗榧屬于中國珍稀瀕危植物資源，為國家I級重點保護野生植物，由于其自然生境遭受破壞和盜伐的威脅，導致種群數量和規模急劇下降、資源不斷減少等問題。為了更全面地保護海南粗榧樹種，建議應從以下3個方面加強研究。

（1）深入開展內生真菌研究。由于海南粗榧資源有限，單純的利用海南粗榧來提取有效藥物，難于規模化生產，但是繼抗癌藥用植物細胞組織培養之后，利用抗癌藥用植物內生真菌來生產抗癌藥物成為一個新的熱點，從海南粗榧內生真菌已發現不少的代謝產物并篩選出具有抗腫瘤活性的菌株及活性成分，可見對于有效藥用成分的篩選和開發，海南粗榧內生真菌具有很大的研究空間。

（2）深入開展培育技術研究。為了能盡快緩解市場對海南粗榧的需求，對海南粗榧種子、扦插及組織培養、細胞培養等繁育技術進行了大量的研究，但至今海南粗榧未能生產大量苗木，還不能為推廣奠定堅實的基礎，而高效的種植技術也是擴大資源量的有效方法，如何克服因為留有位置效應側枝扦插未能產生直立植物（匍匐植株），如何更有效率用側枝扦插產生的匍匐植株，則需要更深入開展培育技術的研究。

（3）做好保育研究工作。海南粗榧為珍稀瀕危保護植物，但至今自然生境下海南粗榧的的光、溫、水、肥、熱等生態學、生物學特性還有許多方面還未清楚，海南粗榧的許多的致瀕原因還未認識到位。因此，需要繼續做好海南粗榧的保育研究。