輻射花粉技術在西瓜單倍體培養中的應用

田花麗，黃冉濤，劉瑞，曹雙，周青輝，張秋月，郭雙雙，范長有

（南陽市科學院，河南南陽473000）

西瓜果肉多汁，果皮可炒食，清涼爽口，具有一定藥用價值[13]。利用單倍體育種技術和分子標記育種技術相結合的方法，可以減少不利影響因子的存在，大大減少培育自交系所需的時間和成本。采用輻射花粉技術培育單倍體植株可以克服離體雌、雄核誘導的弊端，在操作上省時省力。因此，利用輻射花粉培養單倍體以培育西瓜新品種，可助力西瓜產業的發展，具有重要的理論和實踐意義。

1 單倍體及產生途徑

單倍體（Haploid）是指體細胞中僅有配子染色體數目的細胞或個體，具有完整的遺傳物質。將單倍體加倍后得到純合雙單倍體（DH），雜交后代顯隱性突變都可表達，且性狀可以穩定遺傳，是獲取突變體的最佳途徑，也是研究基因功能的基礎[1]。單倍體植株的基因來源相同，易建立進化樹，可探索其親本進化淵源關系，是分子標記技術的最佳材料。由于很多植物存在自交不親和現象，很難從傳統育種方式獲得純合體，單倍體的產生解決了這一問題。利用單倍體技術育種已經在辣椒、甜瓜、甘藍、南瓜、黃瓜、西葫蘆、玉米等作物上得到了驗證[2-8]，該方法可以解決育種時間長、后代性狀不穩定及任務量大等問題。因此，培育出單倍體后再進行雜交育種已經成為當今育種領域的首選。自然界中可以自發形成單倍體的概率極為低下，目前可獲取單倍體途徑主要有自發形成，如假受精、孤雌繁育、孤雄繁育等；離體培養獲得，如離體小孢子培育、離體大孢子培育、輻射花粉或高頻誘導花（原位誘導）。目前應用最多且最成熟的一種方法是離體雄核培育即小孢子培養技術，但有的作物不適用該方法[9]。通過花粉粒離體培養成功獲得單倍體的先例出現在19世紀60年代[10]，葫蘆科作物離體雌核誘導首次獲得西葫蘆單倍體植株是19世紀80年代[11-12]。輻射花粉或高頻照射花需要人為采用某種射線干擾其正常的發育途徑，損害正常的雌雄結合，使其形成單倍體。

2 單倍體培養技術在西瓜中的應用

目前，輻射花粉技術結合離體胚狀體再生在黃瓜、甜瓜上取得了成功，該方法涉及到輻射源及輻射量、胚再生體系優化等技術，在西瓜單倍體誘導上值得效仿[13-15]。離體誘導外植體再生獲得單倍體的體系尚不成熟，試驗過程中涉及到供試材料的品種差異、發育狀況、培養基類型及狀態、外源激素的種類及濃度配比、培養條件等因素的影響，不可控因素多，難度較大。近年來，原位雌核輻射或高頻誘導技術培育單倍體技術在國內外應用較多，此方法無需離體挑取胚，不傷害胚珠細胞發育，且污染率容易控制，但該技術體系還不成熟、穩定[19]。

3 影響輻射花粉誘導的因素

3.1 基因型

基因型是誘導單倍體是否成功的關鍵因素之一，這不單單存在于物種之間，在物種內部也較為明顯。品系與花藥、子房、胚珠等理化性質及抗逆性存在著相互關聯，品系間存在差異[16]。劉曉輝[15]采用紫外照射西瓜花粉時發現，不同品系耐輻射情況不同，小瓜品系優于大瓜品系。因此，在獲取單倍體植株過程中，方式各異，但基因型作為根本影響因子，嚴重影響著其誘導分化及成苗情況。根據現有數據進一步分析確定特異基因并探索其作用機理，在未來研究工作中值得探究。

3.2 授粉季節的影響

環境適宜可以使西瓜的生長達到最佳狀態，雄核、雌核等的發育狀態也最好[17]。龔思[18]在西瓜未受粉子房誘導時發現在秋季種植，日均溫度在21℃~32℃之間時胚狀體誘導率最高。楊紅[19]采用γ射線輻射花粉，發現授粉11~12 d的果實發育最好。由此可知，高溫時期選取開花前或開花初期的材料為外植體，可以提高誘導率。但高溫高濕是瓜類各種病害如枯萎病、炭疽病等高發季節，應選擇高抗的品種作為研究親本。

3.3 輻射源及輻射量情況

輻射源有紫外照射、γ射線等，輻射量的選擇因材料而異，在試驗中起著至關重要的作用。輻射劑量高容易導致花粉粒死亡，輻射劑量低則達不到誘導單倍體的目的。因此，適宜的輻射量是試驗成功與否的重點。劉曉輝[15]采用紫外輻射西瓜花粉得出45 min紫外輻射時花粉僅能存活下來50%，紫外90 min是最佳的輻射劑量。用γ射線輻射花粉粒可成功獲得單倍體植株，裴曉利[22]采用γ射線輻照黃瓜花粉，輻射劑量為150 Gy，這與蘇敏在西葫蘆上的研究結果不一致[23]。楊紅[19]采用γ射線輻射西瓜花粉發現輻射后11 d左右胚挽救成功率高。眾多研究者發現輻射量在半致死量之上為宜，具體輻射劑量應根據試驗情況來確定。

4 再生植株的倍性鑒定

任何途徑獲取的單倍體植株，其染色體倍性都不明確，需要選擇合適的方法鑒別其倍性情況。精準的倍性鑒別是后期工作開展的前提。常用的植株倍性鑒定的方法有：①直接鑒別法，包括計量染色體數目法；②間接鑒別法，包括外觀形態學觀察法、葉片細胞鑒定法、流式細胞儀鑒別法。

單倍體植株整個生長周期長勢均低于正常植株，可看到明顯差異。所以在植株生長早期可通過觀察法初步選出單倍體的植株。外觀形態學觀察法比較直接，主觀性強，耗時。計量染色體數目法具有可靠、精確的特點[23]。流式細胞儀鑒定法是提取完整DNA，用特異的熒光染料對其進行染色，根據DNA含量來合理推測植株的倍性，簡便、快捷、精確，但是費用高；葉片細胞鑒定法是根據葉片中氣孔的形態、葉綠體數量等情況來鑒定植株的倍性。劉曉輝[15]采取根尖通過顯微鏡觀察染色體數鑒定了再生植株的倍性；李玲[20]也采用計量染色體數目法鑒定出了再生苗的倍性；管葦[21]在黃瓜倍性鑒定中發現外觀形態學觀察法和葉片細胞鑒定法可作為黃瓜倍性鑒定的方法，且結果一致。

5 問題及展望

目前西瓜生產中多以高產、高抗品種為主，優質、特色、優良品種欠缺。利用輻射花粉誘導單倍體技術仍不成熟，體系不穩定，因此，應篩選優質基因型，確定適宜的輻射源和劑量，改進再生胚挽救體系，探索出成熟的輻射花粉誘導技術。采用原位輻射花粉誘導雌核，配合離體胚再生恢復技術，將是未來獲得西瓜單倍體的一種可行性技術，可提供更多優質西瓜品種，從而加快西瓜產業發展。