淺談影響ELISA試驗結果的因素

秦萬強

（貴州省務川仡佬族苗族自治縣動物疫病預防監測中心，貴州 務川 564300）

1 ELISA實驗室診斷方法概述

酶聯免疫吸附法 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是一種特殊的試劑分析方法，在免疫酶技術的基礎上發展起來的一種新型的免疫檢測技術。ELISA是以免疫學反應為基礎，根據抗原抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的非放射性標記免疫檢測技術，其試劑易于保存、結果判斷較為客觀，具有敏感性高和特異性強等優點。

2 試驗結果的影響因素

2.1 試劑盒的選擇

試劑盒的質量直接影響結果的準確性。目前市面上生產試劑盒的廠家較多，不同廠家的試劑敏感性、特異性不盡相同，導致檢測結果就會有一定的差別，目前我們使用的試劑盒購自武漢科前有限公司、深圳康百得有限公司和深圳真瑞有限貴公司，不同試劑盒各有優缺點，但主要成分是相同的。

試劑盒使用前應恢復至室溫(20～25℃)，搖勻、結晶溶解后方可使用，顯色液不要暴露于強光和接觸氧化劑，不同品種、不同批號的試劑盒組分不得混用，這是為了保證數據的準確性。不同試劑使用時應防止交叉污染，所有廢棄物在丟棄之前應進行高壓滅菌。

2.2 前期樣品處理

首先是待檢樣品的預處理對檢測結果有一定的影響，樣品須血液凝固析出血清后進行血清分離，一部分血清未析出需用離心機進行血清分離，盡量取上清液，如果混濁會對檢測結果造成一定的干擾；其次是溶血，溶血時紅細胞破裂釋放出具有過氧化物酶活性的物質，干擾試驗結果，進而影響對結果的判斷，因此對于采集來的全血需及時進行血清分離，發現溶血的樣品應棄之不用，短期內（3天內）可將待檢血清樣品保存于2～8℃；若長期保存，應置于-20℃以下環境中，避免反復凍融；最后，就是保證待檢樣品有足夠試驗的用量，有些血清，尤其是雞、牛血清在秋冬季節室外溫度過低時容易出現凝膠狀態，這樣就無法吸取，應在試驗前對待檢樣品進行適當的加熱處理，以保證其融化。

2.3 移液器的使用

應使用準確性高的微量移液器且定期進行校準，對于使用時間過長取液不準確的移液器應及時淘汰，使用移液器時應注意加樣的規范性，在吸取試劑或樣品時應按在移液器的第一檔，不能按在第二檔，不然會造成吸取液體多而結果不準確，吸取待檢樣品時不可速度過快，以免將樣品吸入移液器內，造成交叉污染，影響試驗結果。試驗完成后應及時將移液器調回量程范圍內的最大值，并及時用酒精棉對整個移液器進行擦拭消毒。

2.4 加樣與稀釋

一部分試劑盒所需待檢樣品僅為5 uL，比如深圳康百得生產的羊小反芻試劑盒、豬口蹄疫試劑盒、雞H5亞型抗體檢測試劑盒等，多加或少加1 uL即有20%的誤差，為了保證加樣的準確性，需要將5 uL血清進行倍比稀釋，即用樣品稀釋液對待檢樣品進行1：100倍的稀釋，稀釋好后再從中取100 uL待檢樣品進行試驗，這樣做一定程度上減少了誤差。加樣時應垂直將樣本準確加入微孔底部，避免吸頭碰到包被板的邊緣，移液時盡量準確，慢吸快放，防止濺出或產生氣泡，避免液體外濺殘留在反應孔的上部。每次吸樣需更換吸頭，做到一樣一吸頭，避免交叉污染。加樣品稀釋液、酶標結合物、底物液、顯色液及終止液時可采用多道移液器，迅速完成加液過程。

在稀釋過程中，如果待檢血清過多時，應先稀釋完所有的待檢血清，再加到抗原包被板上，使反應時間一致；另外，每個試劑盒都有相應的洗滌次數，需嚴格按照說明書進行操作，洗滌次數過多或偏少都會使檢測結果出現嚴重偏差，洗滌時每孔需按操作加入等量的洗滌液，防止因洗滌不充分造成非特異性顯色。

2.5 溫度與時間的控制

溫育是 ELISA至關重要的一步。只有在適宜的溫度下抗體和抗原才能充分反應結合，每個試劑盒都有規定的溫育溫度，一般溫育溫度是37℃。不同的溫育環境對檢測結果有影響，在試驗開始之前應提前將電熱恒溫箱開啟，并按照試劑說明書上的要求設置好溫育溫度，以確保能在規定的溫度下進行反應，同時不要反復開關恒溫箱門，以免溫度過低影響酶的反應，從而影響試驗結果的準確性。除此之外，溫育時間也是影響檢測結果的一大因素，在ELISA檢測中，要嚴格按照說明書的要求控制好溫育時間[1]。

2.6 洗板

洗板是否合格直接影響檢測結果的準確性。洗板分人工洗板和洗板機洗板，人工洗板人為主觀因素影響較大，所以在用移液器加樣時一定要保證移液器的準確性和減少人為的誤差。使用洗板機洗板一定程度上可避免環境污染，提高工作效率。目前，務川縣獸醫實驗室采用的是人工洗板方式。洗板時需要注意以下幾點：一是洗滌液應嚴格按照操作說明進行稀釋，不能將洗滌液溢出到孔外以免交叉污染；二是倒掉洗滌液應垂直甩板，不可斜著倒，洗板結束后將板拍干，應垂直將板扣在備好干凈的吸水紙上，且注意每次拍板更換干凈的吸水紙。

2.7 顯色

顯色底物分為A、B兩種液體，加樣時A、B液提前應恢復至室溫，避免強光照射，按順序依次加入不能顛倒，間隔最好不超過1 min，如先將兩液混合再加樣則需保證等體積混合。注意避光顯色，顯色是最后一步溫育反應，酶將無色底物催化反應呈有色。顯色的時間和溫度均是影響結果的重要因素，一定時間內，陰性孔可保持無色，但陽性孔會隨時間的延長而顯色加強，顯色時間不宜過短，因為一些低滴度抗體可能不會及時出現反應，造成假陰性結果；顯色時間過長，對照值偏高或非特異性顯色概率增加，因此顯色時間一定要控制在說明書上規定的范圍內。目前我們使用的 ELISA試劑盒顯色溫度一般為37℃或室溫（20～25℃），顯色溫度不同，檢測出來的結果就不相同，當溫度過低時會導致結合反應速率變慢，顯色不充分，造成低值陽性結果的漏檢，所以操作過程中應嚴格控制溫度。

2.8 波長設置及讀數

讀數時將酶標分析儀置于光源較好的地方，光源不充足不能及時讀取試驗數據，在設置波長時，應根據說明書最好設置雙波長，通常為630 nm和450 nm。由于雙波長可以消除同一塊板上不同孔之間的差異，同時還可消除試樣的背景吸收干擾和混濁干擾，所以會減少試驗數據的誤差[2]。終止反應后的時間對OD值結果有明顯影響，10～15 min陽性結果的OD值逐漸下降，陰性結果的OD值有所上升，所以必須嚴格按照說明書進行操作，最好在加入終止液后10 min內完成上機讀數。

2.9 結果判定

在數據出來后，首先看陽性對照和陰性對照是否滿足說明書上的要求，如果其中一項不滿足條件，則證明試驗不成立，需重新進行試驗，如果都成立，再根據公式計算出試驗結果。

3 其他因素

實驗室的環境也是影響試驗結果的一大因素，合理調控實驗室的通風。實驗室的溫度及濕度可使用空調加以控制，濕度控制在60%左右，注意實驗室的消毒及衛生清潔工作，避免對試驗結果造成污染。在進行試驗時先核對試劑盒是否在有效期范圍，對于未使用完的試劑盒應及時放入2～8℃保鮮室內。另外要加強工作人員專業理論知識的學習，在工作中總結經驗、不斷積累，減少人為因素對試驗結果的影響，提高檢測的準確性，減少假陰性、假陽性結果的出現。