胃食管反流病-Barrett食管-腺癌在表觀遺傳方面的研究進展*

牛 璐，邵 國， 孟憲梅，年媛媛

(1.包頭醫學院，內蒙古 包頭 014060；2.包頭醫學院第二附屬醫院消化內科)

胃食管反流病(GERD)是一種常見并且多發的消化道疾病，并作為Barrett食管(BE)和食道腺癌(EAC)的重要危險因素。通常認為GERD-BE-EAC的發生與發展是環境因素與遺傳相互作用的結果。隨著對胃食管反流及相關疾病研究的不斷深入，表觀遺傳學在胃食管反流病發生發展中的重要作用逐漸被認識，與之相關的表觀遺傳機制主要有甲基化和非編碼RNA的調控。本綜述討論了有關GERD與BE和EAC之間可能的表觀遺傳重疊，這可能對探究胃食管反流病的發病原因和食管腺癌的早期防控有重要意義。

1 GERD-BE-EAC的發生和發展

胃食管反流病(GERD)是由環境和遺傳因素共同作用的復雜疾病，主要癥狀是胃灼熱和反酸，并且通常先于Barrett食管(BE)和食道腺癌(EAC)的發展。流行病學研究表明全球GERD患病率呈上升趨勢，而EAC作為食管癌的主要類型之一，近年來發病率增高且生存率很低[1]。有學者使用LD評分回歸方法估計GERD和BE之間的遺傳相關性為77 %，GERD和EAC之間的遺傳相關性為88 %。這項研究為GERD的多基因基礎提供了第一個證據，并支持GERD和BE以及GERD和EAC之間的多基因重疊[2]。由于食管腺癌患者的發病率逐年上升且預后較差，對食管腺癌的早期病變Barrett食管和危險因素胃食管反流的研究對食管腺癌患者進行早期診斷和防治有重要意義。

BE是EAC的主要癌前病變，每年有0.12 %至0.5 %的BE患者發展為EAC[3]，而BE通常是在慢性胃食管反流(GERD)的背景下出現的。多項研究描述了與EAC相關的風險因素，大約80 %的EAC病例與吸煙史，胃食管反流病，中心性肥胖，低蔬菜水果飲食有關[4]。臨床上，GERD除了表現出胃灼熱和回流的癥狀也經常以非典型方式出現食管外癥狀，如胸痛、牙齒侵蝕、慢性咳嗽、喉炎或哮喘，嚴重影響患者的心理健康和日常生活。然而，目前還沒有非常明確的原因來解釋GERD的發展。

多年來，已發現GERD的發病機制中涉及若干環境因素。在胃食管反流病及其相關疾病中，存在化生-異型增生-癌的變化，上皮細胞內存在體細胞遺傳和表觀遺傳變化的累積，這可能是決定癌癥進展可能性的一個重要因素。表觀遺傳學(epigenetics)是一個新興的研究領域，用于描述基因在不改變序列的情況下是如何與環境相互作用而產生特定表型，是可逆的并且可遺傳的基因表達的變化。其主要內容包括DNA甲基化，非編碼RNA調控和組蛋白修飾，染色質重塑等。而表觀遺傳修飾連接著環境因素與基因表達，提示其可能在GERD-BE-EAC中扮演重要角色。

2 與GERD-BE-EAC相關的表觀遺傳基因

2.1非編碼RNA(ncRNA) 人類基因組大約70 %被轉錄為RNA, 而只有不到2 %編碼蛋白質[5-7]。隨著人們對人類基因組了解的增加，越來越多的證據表明基因組中的非編碼部分在人類的正常生理和疾病中都有著不可或缺的作用[8-9]。在胃食管反流病-Barrett食管-腺癌過程中，ncRNA起到了重要作用。

2.1.1lncRNA lncRNA是一類不編碼功能性蛋白的內源性RNA，其定位于細胞核和細胞質。lncRNA通常具有高度組織或細胞特異性，有可能成為腫瘤診斷的新型生物標志物和潛在的治療靶點。Bartolomei于1991年發現了第一個長的非編碼RNA(lncRNA)H19[10]。Okazaki等人在2002年，首次將lncRNA明確定義為長度大于200個核苷酸的轉錄本[11]。近年來，lncRNAs被證明在表觀遺傳調節和轉錄與轉錄后調節中扮演重要角色[12-13]，尤其在癌癥中[14-15]。

AFAP1-AS1是人類癌癥中的新型致癌性長非編碼RNA，最初于2013年在食道腺癌中發現。AFAP1-AS1是在AFAP1編碼基因位點反義鏈轉錄的上調的lncRNA，Wu等[16]報道AFAP1-AS1在Barrett食管、食管腺癌組織和食管腺癌組織細胞系中過度低甲基化和過表達，在BE和EAC中表現出明顯的低甲基化，同時敲低它并不會明顯改變EAC細胞中AFAP1的表達，但會通過誘導G2/M期停滯以及細胞生長和侵襲減少而導致增殖的減少，提示某些lncRNA可能通過表觀遺傳調控促進腫瘤的發生和發展而不是通過對鄰近mRNA進行調控。推測AFAP1-AS1是在食道細胞中發揮功能性癌前作用的分子，它的過表達與低甲基化有關。

此外，已經證明了一些相關基因或信號通路參與了AFAP1-AS1的致癌功能，例如EMT相關基因和小的GTPase信號傳導Rho/Rac通路，但其特定的上游和下游分子機制需要未來進一步的分析。功能實驗表明，AFAP1-AS1可以促進腫瘤細胞的增殖，遷移和侵襲并抑制細胞凋亡。

在許多情況下，lncRNA通過調節鄰近的編碼基因的表達而起作用，但是仍然有例外。Yang等[17]證實了HNF1A-AS1在EAC組織和細胞系中異常上調，并可能在惡性腫瘤的發展中表現出輔助作用。敲低HNF1A-AS1不會顯著改變HNF1A mRNA的表達。進一步的研究發現，響應HNF1A-AS1抑制，下游癌癥相關的lncRNA H19的表達會明顯降低。

另一個廣受關注的lncRNA基因PVT1已成為多種腫瘤中的癌基因，實驗表明與配對的Barrett食管組織和正常食管組織相比，食管腺癌組織中PVT1表達上調。PVT1的高表達與分化不良、淋巴結轉移和生存期縮短有關。使用PVT1 反義寡核苷酸(ASOs)有效地敲除EAC細胞中的PVT1可導致細胞增殖、侵襲、集落形成、腫瘤球體形成和ALDH1A1+細胞比例降低。在機制上，EAC細胞中PVT1和YAP1相互調節。YAP1對PVT1有正調控作用。實驗發現利用其特異性ASOs靶向PVT1和YAP1可在體內外產生更好的抗腫瘤活性。實驗結果提供了強有力的證據，PVT1賦予食管腺癌一種侵襲性表型，并且是一種不良的預后指標。PVT1和YAP1聯合靶向提供了最高的治療指數，代表了一種新的治療策略[18]。

但是目前還沒有發現與AFAP1-AS1相關的miRNAs，并且關于癌癥患者和健康人血液中的精確濃度和檢測方法并不十分明確，這阻礙了lncRNA的臨床應用。有關lncRNA的研究仍然處在一個早期階段,其與蛋白、miRNAs、mRNAs、ceRNAs和其他lncRNA的關系值得進一步地探究和理解。

2.1.2microRNA MicroRNA(miRNA)是小(18～25個核苷酸)RNA，具有非蛋白質編碼能力，可調節基因的表達[19]。miRNAs對人類約三分之一的基因起調節作用，其調節模式的異常可以引起GERD及其相關疾病的發生發展。miRNA通過刺激靶向信使RNA(mRNA)降解和抑制翻譯在轉錄后水平發揮其調控作用。在多種疾病中，尤其是在惡性腫瘤中，已檢測到miRNA的失調多項研究探索了BE和EAC中miRNA表達水平的變化[20-21]。

miRNA可通過與抑癌基因和轉移抑制基因的結合促進癌癥的發生發展。有研究發現MiR-21靶向抗癌基因和轉移抑制基因，例如程序性細胞死亡4(PDCD4)、腫瘤抑制基因原肌球蛋白1(TPM1)、磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)等，從而證明了其參與了癌癥生長、侵襲和轉移[22]。 重要的是，與鱗狀食道上皮相比，BE和EAC中的miR-21表達上調。與癌旁組織相比，癌性EAC中miR-21過度表達(HR = 4.2， 95 %CI = 1.68-10.61)，表明它可能與多種組織學類型的食管腫瘤有關。但尚不清楚miR-21是通過外泌體途徑從癌細胞中主動分泌還是通過細胞凋亡連續釋放入循環。Maru等報道了EAC中miR-196a的表達增加和不典型增生。miR-196a的假定靶標包括HMGA家族成員和HOX基因(HOXD8，HOX C8，HOXA7和HOXB8)[23]。Luthra等發現針對膜聯蛋白A1(ANXA1)的miR-196a在EAC組織中被上調，MiR-196a抑制ANXA1的表達，隨后發揮抗凋亡作用并有助于EAC細胞存活。并進一步發現miR-196a是BE腫瘤發展的潛在生物標志物，并證明了BE-EAC轉化過程中miR196a表達的逐步上調[24]。Maru等也發現miR-196a在EAC和BE中表達高于正常鱗狀黏膜，并顯示出抗凋亡和促進生長的功能。作者進一步證實，miR-196a通過基于miR-196a的模擬和熒光素酶報告基因檢測可特異性靶向S100A9 3’UTR，SPRR2C和KRT5。因此miR-196a水平可能成為早期食管腺癌檢測中的重要工具[25]。進一步確認miRNA的靶向基因對于了解該miRNA的詳細生物學功能并確定其在EAC發展中的作用十分重要。

2.2甲基化 DNA甲基化是一種在胞嘧啶的CpG位點的碳-5位上加一個甲基的現象，CpG位點由一個胞嘧啶與鳥嘌呤相鄰組成。這種表觀遺傳學改變被認為影響基因表達，因此可能是腫瘤發生的一個因素。在Barrett細胞中發現了許多抑癌基因、DNA修復和黏附分子基因的異常甲基化，如AKAP12、22、APC23 24和GPX3[26-27]。在它的發生過程中，還觀察到抑癌基因(p16、APC、RUNX3、HPP1、TIMP3等)的啟動子甲基化[28]。這樣的研究已經闡明，啟動子超甲基化通常是GERD-Barrett-EAC序列中的一種早期和進行性的異常表現,表明這些基因的差異甲基化有一定意義。與正常食管黏膜相比，BE和EAC都經常高度甲基化，盡管其水平是異質的。例如，CDKN2A啟動子(p16INK4a)的超甲基化很常見，并與BE的腫瘤進展有關，并伴有9p21丟失，導致CDK2NA失活，這是有創EAC中的常見發現[26-27, 29]。Wu等[16]評估了BE和EAC中全基因組的低甲基化，盡管CpG的密度高，但低甲基化被證明是BE的主要表觀遺傳變化。另外,非編碼區域中的變化比編碼區域中的變化大。此外，較大的非編碼區顯示更多差異甲基化。有研究通過甲基化陣列分析了進行性增生與非進行性增生的Barrett食管患者組織，鑒定出了44種甲基化標記，它們可以區分發展為腺癌或保持靜止狀態的非增生性Barrett食管。并且對最近鑒定的腫瘤抑制因子OR3A4(探針cg09890332)的低甲基化已在一個單獨的樣本組中進行了驗證， 發現兩組之間的拷貝數沒有差異，但是在進展組中觀察到了偏向低甲基化的總體趨勢。因此OR3A4的低甲基化可以對非增生性Barrett食管患者進行危險分層，并可能構成未來監測計劃的基礎[30]。

3 展望

隨著GERD變得越來越普遍，以及癌癥風險的增加，傳統上BE患者定期接受內鏡檢查，如果沒有其他異常發現，通常每2至3年進行一次。因此，患者一生中通常要接受多達10次或更多次的內窺鏡檢查，這就需要在GERD的管理中采用更加量身定制的方法。不同類型的表觀遺傳學分子機制通常并不單獨在疾病中起作用，它們之間也存在協同作用。從表觀遺傳學的角度對疾病的發病原因進行探究，以在對患者的管理中進行危險分層，及時進行更加有針對性的干預措施。這將更有益于對GERD的病因的理解及GERD相關癌癥的早期預防和治療。