NADPH氧化酶在心肌纖維化中的作用機制及研究進展

丁雯，李文靜，廖海含，張楠，周子穎，牟山琪，唐其柱，夏豪

(武漢大學人民醫院心血管內科，武漢 430000)

心肌纖維化是指細胞外基質蛋白在心臟間質的過度沉積，嚴重的心肌纖維化會影響左心室壁的正常功能，導致心臟收縮或舒張功能障礙。盡管心肌纖維化是心肌肥厚、心力衰竭等多種心臟疾病的共同病理特征，但其具體的病理機制尚未完全明確，目前也未發現能有效改善心肌纖維化的方法。NADPH氧化酶(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX)廣泛表達于心血管系統，且與其他在酶促反應中附帶產生活性氧類的酶不同，NOX是專職產生活性氧類的酶。在心肌重構的病理狀態下，NOX失調是心臟氧化應激的重要原因之一，而長期的氧化應激狀態會導致心肌肥厚、心肌纖維化等一系列心臟病理改變。研究表明，NOX在心肌纖維化的發生發展中發揮著不容忽視的作用[1-2]。因此，明確NOX對心肌纖維化的調節機制有助于更深入地了解心肌纖維化的病理過程。現通過闡述NOX1、NOX2、NOX4和NOX5在心肌纖維化進程中的作用，探討心肌纖維化的病理機制，以期為心肌纖維化的治療提供新思路。

1 NOX與心肌纖維化的關系

NOX是一種以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸為電子供體，將氧還原為超氧陰離子和過氧化氫的多亞基跨膜酶。NOX家族由催化亞基(Nox1～5、Duox1、Duox2)、調節亞基(p22phox、p47phox、p67phox、p40phox)以及主要結合配偶體(Rac)組成[3]。NOX的催化亞基由多種不同的基因編碼，根據催化亞基的不同，NOX分為不同亞型，心血管系統主要表達的亞型有NOX1、NOX2、NOX4及NOX5，其中NOX1、NOX2、NOX4存在于心肌細胞、心臟成纖維細胞、內皮細胞及血管平滑肌細胞中，而NOX5僅存在于內皮細胞和血管平滑肌細胞中[1]。NOX家族不僅參與內皮細胞遷移、血管生成及炎癥反應等多種生理過程，同時也參與心肌肥厚、心肌纖維化等病理過程。病理條件下，NOX產生的活性氧類可增加數倍，進而改變細胞內生物大分子的功能及氧化還原狀態[2,4]。

心肌細胞胞外基質生成與降解失衡所致的瘢痕組織生成稱為心肌纖維化。在氧化應激狀態下，活性氧類參與調節基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)及金屬蛋白酶組織抑制物的表達，過氧化物通過促進成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化而間接促進細胞外基質的合成[5]。因此，NOX失衡導致的氧化還原狀態的改變與心肌組織中膠原的沉積密切相關。根據纖維化的起因，心肌纖維化可分為修復性心肌纖維化和反應性心肌纖維化，前者主要是缺血所致的心肌細胞死亡后的修復反應，而后者則是與肥厚型心肌病相關的間質與血管周圍的纖維化[6]。不同起因所致的心肌纖維化中，受氧化還原調節的信號通路也不盡相同，各型NOX則通過調節腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、MMP等促纖維化通路參與纖維化進程。

2 NOX各亞型在心肌纖維化進程中的作用機制

2.1NOX1在心肌纖維化中的作用機制 NOX1的主要功能是產生超氧化物，并將其迅速轉化為過氧化氫。NOX1可被多種激動劑如促炎因子(腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β)、氧化型低密度脂蛋白等激活。此外，血管活性肽、脂多糖、血流剪切力等可上調血管壁中NOX1的表達[7-11]。NOX1復合體由催化亞基Nox1、調節亞基(p22phox、p47phox、p67phox)及Rac1構成，在外界刺激下，p47phox的絲氨酸殘基發生磷酸化，導致構象改變，使調節亞基轉位至膜上，從而激活NOX1。生理狀態下，低水平的NOX1參與血管生成以及細胞的生長、增殖、遷移、凋亡等多種生理過程[8]。但在炎癥等病理因素刺激下，心血管系統中NOX1的表達顯著上調，此時遠高于生理水平的NOX1產生過量的超氧化物，加劇心血管系統的病理性重構[12]。

在Iwata等[13]的研究中，敲除NOX1基因能夠抑制阿霉素誘導的心臟毒性中羥基脯氨酸、纖維粘連蛋白、結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)等促纖維化因子的升高，減輕心肌纖維化。心肌細胞以NOX1依賴的旁分泌形式分泌鈣結合蛋白S100A1，促進成纖維細胞的增殖與膠原合成[13]。在慢性胰腺炎、肝損傷等其他器官疾病中，NOX1也促進了成纖維細胞的膠原合成[14-16]，在糖尿病腎病中，NOX1表達的抑制減輕了腎臟纖維化[17]。另有文獻報道，NOX1參與了自發性高血壓中醛固酮介導的血管纖維化[18]。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)能夠激活心肌細胞中的p47phox亞基，以誘導氧化應激[19]，由于調節亞基p47phox的活化能夠激活NOX1，故推測NOX1很可能參與了RAAS相關的心肌纖維化。雖然既往研究揭示了NOX1的促纖維化作用，但NOX1在心肌纖維化中的確切作用尚不明確。根據NOX1在其他器官纖維化過程中的作用推測，NOX1對心臟成纖維細胞的作用可能是揭示其在心肌纖維化中確切作用機制的潛在切入點。

2.2NOX2在心肌纖維化中的作用機制 NOX2主要在心肌細胞和內皮細胞表達，生理狀態下參與血管張力調節、免疫防御、信號轉導等，并可作為氧感受器。NOX2復合體由催化亞基Nox2、調節亞基(p22phox、p47phox、p67phox、p40phox)以及Rac組成，活化的NOX2主要位于細胞膜，以產生超氧陰離子為主，Rac與細胞膜的結合是NOX2激活的關鍵步驟[20]。病理狀態下，上調的NOX2通過產生過量的活性氧類參與病理性信號通路的信號轉導，以促進心肌重構。已知的誘導心肌細胞和內皮細胞產生NOX2的主要刺激因素有G蛋白偶聯受體激動劑(AngⅡ、內皮素1)、生長因子、細胞因子(腫瘤壞死因子-α)、機械應力、代謝因素(葡萄糖、胰島素)等[3]。

Wang等[21]發現，與8月齡大鼠相比，30月齡大鼠心臟中的NOX2表達水平顯著升高，CTGF轉錄增加、心肌纖維化面積顯著增大、MMP-2與金屬蛋白酶組織抑制物的表達失衡，且血管緊張素轉換酶、血管緊張素原、血管緊張素1型受體等RAAS組成因子表達增加，同時連續注射AngⅡ28 d的8月齡大鼠的心肌纖維化改變與30月齡衰老大鼠一致。在Johar等[22]的研究中，皮下注射AngⅡ2周后小鼠心臟表現出NOX2活性增加，間質纖維化面積增大，纖維粘連蛋白、前膠原Ⅰ、CTGF、MMP-2等促纖維化因子表達增強；而在NOX2-/-小鼠的心臟中以上表現卻被抑制，且螺內酯通過抑制醛固酮受體間接抑制了AngⅡ誘導的心臟NOX2活性的增強以及間質纖維化面積的增加。以上研究提示，RAAS的激活可以上調NOX2的表達，而后者則繼續促進促纖維化因子的表達和細胞外基質蛋白合成與降解的失衡，NOX2在RAAS誘導的心肌纖維化中發揮著重要的推動作用。Zhao等[23]在阿霉素誘導的心肌重構中發現，與野生型小鼠相比，NOX2-/-小鼠表現出心肌纖維化區域縮小、促纖維化基因如前膠原Ⅲα、TGF-β、CTGF等表達減少以及MMP-9活性降低。在阿霉素誘導的心臟氧化應激中，Lin等[24]用抗氧化劑黃芪甲苷抑制了心臟中NOX2的表達，心肌纖維化面積也隨之減少，推測NOX2在阿霉素誘導的心肌纖維化中發揮促進作用，抗氧化劑對氧化應激的抑制作用可能在一定程度上抑制了NOX2的激活。此外，Yin等[25]還發現，NOX2可通過活性氧類/p38通路介導異丙腎上腺素誘導的心肌纖維化。綜上，NOX2促進了AngⅡ、阿霉素及異丙腎上腺素等多種病理刺激下的心肌纖維化。區別于動物心臟纖維化模型中人為干預的單一性，人體心臟疾病中心肌纖維化的發展常受到神經體液等多因素的調控，考慮到NOX2廣泛參與了不同刺激誘導的心肌纖維化并且是多種促纖維化通路的共同下游效應物，NOX2有望成為治療心肌纖維化的重要靶點。

Li等[26]發現，遠端非梗死心肌組織中NOX2的激活增加了內質網應激，促進了心肌梗死后左心室的心肌纖維化進程。Looi等[27]發現，在心肌梗死模型中，與野生型小鼠相比，NOX2-/-小鼠心肌收縮功能改善，左心室擴張、心肌細胞肥厚、細胞凋亡、間質纖維化明顯減少、MMP-2活性降低。進一步研究表明，心肌細胞特異性過表達NOX2小鼠的CTGF、核因子κB、MMP等促纖維化因子表達增加，間質纖維化明顯增加，而內皮細胞特異性過表達NOX2小鼠與野生型小鼠細胞的心肌纖維化水平比較差異無統計學意義[28]。因此，NOX2對纖維化的促進作用有細胞特異性，與內皮細胞的NOX2相比，心肌細胞的NOX2在心肌梗死后心肌纖維化等一系列心室重構過程中發揮著重要的作用。在心肌梗死模型中，內皮細胞特異性過表達NOX2小鼠的心肌纖維化程度與野生型小鼠并無差異；但在AngⅡ誘導的心肌肥厚與纖維化中，內皮細胞特異性過表達NOX2小鼠心臟卻表現出內皮-間充質轉化增強，而這種內皮-間充質轉化增強也促進了心肌纖維化進程，使心臟在保留收縮功能的同時發生了左心室舒張功能障礙[29]。由此可見，NOX2在心肌纖維化中的作用不僅有細胞特異性，還取決于纖維化的起因，具有通路特異性。作為研究較多的NOX家族亞型，NOX2在心肌纖維化中的作用是目前心肌纖維化研究的熱點之一，也為心肌纖維化的治療提供了重要靶點。

2.3NOX4在心肌纖維化中的作用機制 NOX4是心血管系統中表達量最多的NOX家族成員，由催化亞基Nox4與p22phox結合而成，主要定位于內質網膜和線粒體膜上，其產生的活性氧類以過氧化氫為主。與其他NOX亞型不同，NOX4的激活不需要Rac或其他胞質調節亞基的參與，生理狀態下NOX4在體內可以持續保持低水平的活性，其產生的低水平的活性氧類還可作為第二信使參與細胞內信號轉導，從而促進細胞增殖、遷移、凋亡、自噬等過程。但在心力衰竭、心臟壓力超負荷等病理狀態下，心肌細胞線粒體中的NOX4上調，活性氧類增加，線粒體蛋白被氧化，線粒體功能障礙導致的電子泄漏又導致了活性氧類的增加[30]，所以作為線粒體氧化應激的重要來源，NOX4是心臟壓力超負荷期間氧化應激和心功能障礙的關鍵介質。

心臟特異性過表達NOX4的轉基因小鼠在13～14月齡時表現出左心室功能下降，心臟過氧化物水平升高以及纖維化增加[31]。不同于生理水平NOX4的正常生理功能，高于生理水平的NOX4表現出對衰老心臟纖維化的不利影響。研究表明，多種激動劑(如TGF-β、AngⅡ)和細胞應激狀態(如壓力負荷、缺氧、心肌缺血)等均可上調NOX4的表達，其中TGF-β可在多種類型的細胞中上調NOX4的表達[30,32]。TGF-β促進成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化以誘導心肌纖維化，TGF-β基因敲除小鼠表現出明顯的抗心肌纖維化和抗心肌肥厚效應[33]。在高血壓大鼠的心臟中，TGF-β的抑制伴隨NOX表達的下調與膠原蛋白表達的減少[34-35]。Cucoranu等[36]的研究證明，在心臟成纖維細胞中，NOX4產生的活性氧類通過長期促進Smad2/3的磷酸化，上調α-平滑肌肌動蛋白的表達，進而介導TGF-β誘導的心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化。在心臟特異性過表達TGF-β的小鼠中，心室成纖維細胞與心房成纖維細胞中NOX4表達量的差異導致了兩者膠原蛋白沉積量的差異[37]。NOX4基因敲除能夠消除TGF-β引起的心臟成纖維細胞中α-平滑肌肌動蛋白與膠原蛋白表達的增加[38]。Goh等[39]用線粒體靶向抗氧化劑處理經TGF-β刺激的心臟成纖維細胞后，成纖維細胞的線粒體氧化應激明顯改善、NOX4被抑制，同時細胞中TGF-β/Smad通路蛋白顯著下調，并伴隨CTGF和膠原蛋白的減少。綜上，NOX4是TGF-β誘導的心肌纖維化的重要下游效應物，而依賴于NOX的氧化還原信號也可以正反饋的方式調節TGF-β/Smad信號轉導通路。雖然這一正反饋調節已在腎小管上皮細胞中得到了證實[40]，但仍需要進一步研究以確認在心肌成纖維細胞中是否也存在同樣的正反饋調節。

Zhao等[41]的研究發現，在AngⅡ誘導的心肌重構中，心肌中上調的NOX4通過激活蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/核因子κB信號通路推動心肌纖維化。在酒精性心肌病大鼠中，腎素受體通過激活心臟成纖維細胞中的NOX4增加膠原合成，促進心臟纖維化與心功能惡化[42]。此外，AngⅡ通過激活NOX4依賴的細胞外調節蛋白激酶誘導心臟成纖維細胞遷移[43]。抑制醛固酮降低NOX4的活性，從而減少過氧化氫誘導的心臟成纖維細胞的遷移與增殖[44]。RAAS中的AngⅡ、腎素受體及醛固酮均可通過NOX4促進心肌纖維化。NOX4也是RAAS的下游效應物，并在RAAS誘導的心肌纖維化中扮演重要角色，所以對NOX4的干預極有可能會對心臟纖維化的發展產生較大影響。生理狀態下NOX4持續激活，如何將心臟中NOX4的激活控制在既不影響生理功能又不加劇纖維化或許是下一步研究的難點。

2.4NOX5在心肌纖維化中的作用機制 NOX5僅由催化亞基Nox5構成，是一種鈣依賴的NOX亞型，主要在血管中表達，分布于內質網等核周細胞器中。NOX5產生的活性氧類為超氧化物與過氧化氫。生理狀態下，NOX5可引起的血管收縮[45]，并在多種類型的細胞中調節鈣離子內流以及信號轉導。NOX5絲氨酸/蘇氨酸殘基的磷酸化可調控NOX5對鈣離子的敏感性，多種蛋白激酶(如蛋白激酶C、胞外信號調節激酶1/2)可影響NOX5的磷酸化，促炎轉錄因子(如核因子κB、激活蛋白-1)能夠上調NOX5的表達[46]。

在動脈粥樣硬化、高血壓、心肌梗死以及主動脈瘤等疾病中，血管中NOX5的表達增加[46-48]。在人主動脈內皮細胞中過表達NOX5增加了環氧合酶2的表達與前列腺素E2的合成，從而促進炎癥反應[49]，心肌細胞特異性表達人源NOX5加重了心臟壓力超負荷小鼠的左心室肥厚、間質纖維化和收縮功能障礙[50]。NOX5廣泛參與了心血管系統疾病的病理過程，并很可能促進了壓力超負荷誘導的心臟病理性重構。此外，NOX5的過表達能夠促進人肝星狀細胞的增殖與纖維化反應[51]，而內皮細胞或血管平滑肌細胞特異性表達人源NOX5加重了糖尿病小鼠的腎纖維化[52]。由于心肌纖維化是多種心臟疾病的共同表現，再加上NOX5參與了腎臟與肝臟的纖維化，推測NOX5可能參與了心肌纖維化過程。由于NOX5不同于其他NOX亞型的結構以及鈣依賴特性，可能在心肌纖維化中發揮與其他NOX亞型不同的作用。但由于嚙齒類動物缺乏NOX5的表達，動物實驗的缺乏在一定程度上限制了NOX5的基礎研究，目前尚不清楚NOX5在心肌纖維化中的確切作用。

3 小 結

作為活性氧類的重要來源，心血管系統中的NOX通過不同的作用機制促進心肌纖維化的進程。但也有研究認為，在應對慢性壓力負荷的心臟適應中，心肌細胞中的NOX4能夠保留心肌毛細血管的密度，通過增加血管生成起心臟保護作用[53-54]。在心臟的缺血再灌注損傷中，NOX2與NOX4可作為心肌適應缺氧的生理性感受器，產生低水平的活性氧類，并通過調節缺氧誘導因子-1α和過氧化物酶體增殖物激活受體α發揮心肌保護作用[55-56]。所以NOX產生的活性氧類既可以促進心肌纖維化，在心肌重構中表現出不利作用，也可以在心肌的慢性缺氧適應中發揮保護作用，而其是否表現出不利作用取決于活性氧類的基礎水平，這可能是臨床上單純使用非特異性抗氧化劑抑制活性氧類治療心肌纖維化結果不理想的原因之一。作為專職產生活性氧類的酶，NOX調節方式的復雜性為心肌纖維化提供了一種細胞、組織或通路特異性的潛在治療方式。在未來的研究中，對特定NOX亞型的調控可能是未來心肌纖維化治療的新方向。