環狀RNA在整形外科中的研究進展

張澤亞，林琳，潘博，蔣海越

(中國醫學科學院北京協和醫學院整形外科醫院整形七科，北京 100144)

環狀RNA(circular RNA，circRNA)屬于非編碼RNA。作為生物體內重要調節分子，circRNA在機體的生長發育、細胞代謝、分化、增生與凋亡過程中發揮著重要作用，同時在神經系統和心血管系統等疾病的發生發展、惡性腫瘤的發生、轉移及擴散過程中扮演重要角色[1-4]，并因其在疾病中表現出的較高敏感性而被作為某些疾病的生物標志物或可能的治療靶點。既往文獻表明，circRNA可通過RNA海綿作用[5]等生物功能改變相關遺傳物質的表達與活性，調節疾病的發生發展。且大量實驗研究在腫瘤研究領域已相繼開展，整形外科所涉及疾病具有覆蓋面廣、疾病種類多樣、人群發病率較高等特點，其相關遺傳學因素極其復雜，通常與母體孕期所暴露的環境、精神、感染等復雜因素存在關聯。先天性畸形疾病以及皮膚軟組織腫瘤往往影響患者容貌或體態的美觀，給患者身心造成潛在損害。近年來，整形外科手術不斷完善與發展，但手術創傷以及術后可能發生的繼發畸形仍對患者的康復產生影響。現就circRNA及其生物學功能、circRNA在整形外科相關疾病(血管瘤、牙槽嵴裂、難愈性創面等)中的研究進展予以綜述，以期為及時預防和治療整形外科相關疾病提供思路與方向。

1 circRNA概述及其生物學功能

circRNA作為序列保守的非編碼RNA，在真核細胞中含量豐富，是一類通過對前體信使RNA(messenger RNA，mRNA)進行反向剪接，使5′端帽和3′端尾共價連接，構成無PolyA尾巴的環形閉合結構RNA[6-7]。circRNA最初由學者在電子顯微鏡下觀察真核細胞細胞質時發現，但除了在小鼠睪丸中發現的來自Y染色體性別決定基因的睪丸特異circRNA被認為可能具有功能外，其余circRNA則被認為是異常剪接所產生的“廢物”[8]。隨著高通量測序技術和生物信息學技術的不斷發展，包括circRNA在內的非編碼RNA的醫學生物學功能逐漸引起學者的廣泛重視。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)與微RNA(microRNA，miRNA)在間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)的多能性、分化、自我更新方面起重要作用。lncRNA TINCR通過海綿作用機制與miR-761關聯，進而調節WNT家族成員2，從而影響鼠MSC的遷移，為尋找增強MSC歸巢能力的潛在靶點提供了方向[9]。與lncRNA相比，circRNA作為哺乳動物細胞中的另一類非編碼RNA，穩定性和序列保守性更高[10]。circRNA可作為競爭性內源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)，通過與miRNA關聯，間接調節基因表達。基因本體通路分析表明，ceRNA與面部形態發生及發育的某些基因被沉默相關，可參與細胞凋亡進程[10]。與miRNA不同，在很大程度上circRNA的功能和調控機制尚不清楚。隨著高通量測序和信息技術的發展，大量circRNA被發現可以作為生命體重要調節因子，通過海綿作用機制與特定miRNA共同參與多種生理和病理過程，并參與miRNA介導的轉錄后調控網絡[11]。

在調控基因表達方面，circRNA參與了基因表觀遺傳調控、基因轉錄、基因轉錄后調控過程。①在基因表觀遺傳調控方面，Liu等[12]對circRNA與肝細胞癌的腫瘤擴散與轉移關系的研究發現，肝細胞癌小鼠模型circRNA-5692的過表達可促進殘疾基因同源物2相互作用蛋白基因(抑癌基因)的去甲基化，進而降低上皮-間充質轉化，并抑制已在體內種植的肝細胞癌的生長。Yu等[13]發現，嗜鉻細胞瘤合并副神經節瘤患者的腫瘤組織及相鄰正常組織中存在3種差異表達的circRNA(circ_0000567、circ_000289以及circ_0004473)，其可通過調節組蛋白甲基化過程的方式參與嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤的發病。②在基因轉錄調控方面，Bose和Ain[14]的研究顯示，circRNA在基因轉錄起始階段[15]以及基因延伸階段(調控RNA聚合酶Ⅱ轉錄延長關鍵因子)[16]中均發揮了重要作用。③在基因轉錄后調控方面，Ashwal-Fluss等[17]發現，在果蠅及人類中，盲肌蛋白剪接因子直接促進盲肌circRNA生物合成。此外，Bose和Ain[14]發現，在盲肌蛋白剪接因子輔助下，盲肌circRNA大量生成，并通過海綿作用結合盲肌蛋白，抑制了盲肌circRNA的自身生成。Ren等[18]發現，人類circRNA(circ_0001178)通過上調鋅指E盒結合同源異形盒1(上皮-間充質轉化的關鍵觸發因子)促進大腸癌轉移，而上調后的鋅指E盒結合同源異形盒1可通過與circ_0001178啟動子區域的物理結合上調circ_0001178的自身表達。

在與蛋白質的相關作用方面，circRNA可作為蛋白質的引導分子。Jie等[19]對circRNA與胃癌關系的研究發現，胃癌組織中的circMRPS35將賴氨酸乙酰基轉移酶7招募引導至叉頭框轉錄因子(forkhead box transcription factor，FOX)O1和FOXO3a基因的啟動子上，觸發其下游靶基因的后續表達，通過circMRPS35/賴氨酸乙酰基轉移酶7/FOXO1/FOX3a通路抑制癌細胞的增殖與侵襲。此外，circRNA作為蛋白質的支架分子。人抗原蛋白R(human antigen R，HuR)作為RNA結合蛋白，可結合3′非翻譯區富含尿苷酸的元件來防止mRNA被降解[20]，具有穩定RNA結構的功能[21]。HuR在真核生物組織中廣泛表達，在人類頭頸部腫瘤，尤其是喉鱗狀細胞癌中顯著升高[22]。細胞周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)基因是一種在包括喉鱗狀細胞癌在內的多種人類腫瘤中過表達的原癌基因[23]。Zang等[24]篩選了CCND1衍生的circRNA發現，喉癌患者中的circ CCND1(circ_0023303)呈高表達。實驗驗證顯示，HuR可與circ CCND1的83～134堿基對結合，并介導circ CCND1對CCND1 mRNA穩定性的調節，同時circRNA能夠與RNA結合蛋白物理結合，調節基因表達的可能性[25]。Yang等[26]在胃癌患者中發現HuR來源的circHuR可與CCHC型鋅指蛋白相互作用，繼而抑制其與HuR啟動子的結合，從而下調HuR，抑制腫瘤增殖。

2 circRNA與相關整形外科疾病

2.1血管瘤及黑色素瘤 嬰幼兒血管瘤(infantile hemangioma，IH)是嬰幼兒中最常見的軟組織腫瘤，發病率約4.5%[27]。目前公認的臨床一線治療方案是口服普萘洛爾[28]，但可能引發支氣管哮喘、低血壓、高鉀血癥等并發癥[29]。糖皮質激素治療(可能誘發兒童骨質發育不良、胰島素抵抗)[30]以及手術和激光療法(可導致患兒治療區域瘢痕增生)[31]均不作為首選。因此，IH的精準治療成為IH診療的研究熱點。circRNA在腫瘤發生發展中起著重要作用，但IH中circRNA的表達模式和作用機制尚不清楚。Fu等[32]首次揭示了circRNA在IH中的表達譜，為進一步闡明circRNA在IH發病機制中的作用奠定了基礎。Li等[33]對IH患兒和健康兒童進行皮膚組織的取樣發現，在已鑒定的9 811個circRNA中，IH病變皮膚組織與正常皮膚有249個circRNA表達存在差異，124個circRNA出現上調，125個circRNA呈下調狀態；將存在差異表達的circRNA通過RNA測序驗證發現，IH病變皮膚組織中circRNA(circ_001885、circ_006612)的表達分別是正常皮膚組織的12.33倍和7.13倍，其可能與IH的發生密切相關。Yuan等[34]發現，circAP2A2在IH患兒血管瘤細胞的胞質中高度表達，抑制circAP2A2可下調血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)的表達，敲除circAP2A2可顯著抑制血管瘤細胞的生長、增殖、侵襲和遷移；同時，miR-382-5p則被發現在血管瘤細胞中低表達，與circAP2A2表達呈負相關。circAP2A2利用海綿作用調節miR-382-5p，抑制miR-382-5p生理功能。VEGFA是miR-382-5p的直接靶點，VEGFA水平在血管瘤增殖期顯著升高，在消退期逐漸降低，與IH的發生發展高度相關[35]。Yuan等[34]在蛋白印跡實驗及Transwell實驗發現,敲除miR-382-5p可使敲除circAP2A2所致的VEGFA下調得以部分恢復，下調miR-382-5p可以促進細胞遷移和侵襲，且下調miR-382-5p及circAP2A2可以恢復細胞遷移和侵襲。circAP2A2可通過circAP2A2/miR-382-5p/VEGFA通路調節IH細胞的代謝、增殖，可將circAP2A2作為潛在的IH治療靶點進行更深入研究。

黑色素瘤源于皮膚黑色素細胞的惡變，惡性程度極高，預后差[36-37]。深入探究黑色素瘤的分子發病機制、尋找黑色素瘤新的治療靶點一直是黑色素瘤治療的研究熱點。目前，circRNA在黑色素瘤中所發揮的作用與相關機制尚不清晰。Tian等[38]發現，在黑色素瘤患者組織和細胞中，circFOXM1表達升高、miR-143-3p表達降低；若circFOXM1缺陷，則會阻礙黑色素瘤細胞的增殖、侵襲和糖酵解，進而促進黑色素細胞的凋亡。Jin等[39]觀察到人類黑色素瘤組織中的circMYC明顯上調，黑色素瘤細胞的增殖加快，故可將circMYC作為黑色素瘤治療過程中潛在生物標志物予以進一步研究。Chen等[40]采用實時定量聚合酶鏈反應檢測黑色素瘤患者組織標本和細胞系中circ_0017247的表達發現，circ_0017247在黑色素瘤組織的表達水平明顯高于黑色素細胞痣皮膚組織；沉默circ_0017247后，黑色素瘤細胞遷移距離明顯縮短。此外，Chen等[40]發現，敲除circ_0017247黑色素瘤裸鼠移植模型的遷移和侵襲的黑色素瘤細胞數量明顯減少。

2.2circRNA與非綜合征型口面部疾病 唇腭裂是整形外科中最常見的先天性發育性畸形，不同地區發病率不同，總體發病率約為18.9/10 000[41]。唇腭裂病因復雜，隨著遺傳學研究的不斷深入，可能的致病基因位點不斷被發現[42-43]。目前circRNA與唇腭裂及其發生發展的關系的研究較少，其發生機制尚不明確。腭裂是因口腔上壁中線腭架融合失敗而引發的先天性口面部畸形[44]。Shu等[45]為了探討作為ceRNA的circRNA在腭裂中作用的潛在機制，利用妊娠14.5 d、由全反式視黃酸誘導的小鼠腭裂模型，通過對高通量測序得到的胚胎腭架組織運用RNA測序技術和miRNA測序技術對數據進行系統分析發現，共有39個circRNA、18個miRNA和936個mRNA表達異常。通過構建并驗證這些circRNA相關的ceRNA網絡，確定了circRNA0954-miR881-3p-蛋白激酶A調節亞基1α ceRNA網絡是參與小鼠腭裂發生的樞紐。該研究根據先天性疾病的發病特點，有針對性地選擇哺乳動物胚胎作為研究模型，在一定程度上支持了circRNA可作為某些先天性畸形或組織缺損疾病的生物標志物來加以研究的合理性，為更深層次胚胎發育學層面的研究提供了方向。

牙槽嵴裂常見于唇腭裂患者，該病影響上頜牙弓的連續性，致使裂隙部牙齒萌出過程受阻、扭轉錯位、伴有口鼻瘺及鼻底塌陷畸形。骨移植是牙槽嵴裂的首選治療[46]，考慮到免疫排斥反應，臨床常選擇自體骨作為骨來源。此外，在口腔牙體種植上頜磨牙領域，若因先天發育導致上頜竇底至牙槽嵴的距離過短，缺乏足夠的骨組織支持時，一般采用上頜竇底提升術解決由骨量不足而導致無法行牙體種植術的問題，術中所需骨移植來源亦以自體骨為佳。但自體骨的獲取過程會導致患者的額外創傷。有報道顯示，上頜竇膜及其衍生的成骨前體細胞在體外和體內均具有成骨潛能[47]。從上頜竇膜分離出的上頜竇膜干細胞(maxillary sinus membrane stem cells，MSMSCs)在體內移植后能長時間保持其干細胞樣特性，并能分化為成骨細胞[48-49]。故MSMSCs可作為提升手術和骨組織工程研究中用于骨增強的細胞來源[50]。骨形態發生蛋白2可誘導異位骨和軟骨形成，在骨形成和改建過程中起重要作用[51]，并參與相關干細胞的成骨化過程[52-53]。Peng等[54]應用基因芯片技術檢測正常和骨形態發生蛋白2誘導的MSMSCs成骨分化過程中的circRNA表達譜，確定了潛在的關鍵circRNA——circRNA_33287，并發現circRNA_33287可通過海綿作用調節miR-214-3p，影響成骨分化進程。此外，Peng等[54]的研究顯示，circRNA_33287的表達量與MSMSCs成骨分化呈正相關，過表達circRNA_33287可增強內源性Runt相關轉錄因子2、成骨細胞特異性轉錄因子和堿性磷酸酶的表達。人RUNT相關轉錄因子3基因是骨形態發生蛋白9誘導骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的重要調節因子。研究發現，人RUNT相關轉錄因子3基因是miR-214-3p的直接靶點，circRNA_33287通過海綿吸附miR-214-3p調節人RUNT相關轉錄因子3表達，通過抑制miR-214-3p激活人RUNT相關轉錄因子3，促進MSMSCs體內異位成骨[55]。該研究結果可能為MSMSCs的成骨分化提供新的分子機制，為上頜骨相關骨骼再生提供新的研究靶點。

2.3circRNA與涉及顱面畸形的綜合征 唐氏綜合征亦稱21-三體綜合征，是最常見的導致患兒智力殘疾的遺傳病[56]，以輕中度學習障礙、顱面畸形、低眼壓為主要臨床特征[57]。產前篩查主要在妊娠早期和中期進行，運用超聲篩查、孕婦血清篩查和聯合篩查方案對胎兒進行評估[58]，但這些產前篩查措施的假陰性率和假陽性率均較高[59]。盡管羊膜穿刺術、絨毛膜采樣、臍帶血采集等侵入性產前診斷方法的結果可靠，但易導致出血、感染、流產等并發癥[60]的發生。因此，尋找新的孕期生物標志物，以進一步提高孕期唐氏綜合征的產前篩查水平至關重要。circRNA可作為疾病診斷和療效評估的生物標志物，在生理條件下，血清circRNA的表達相對穩定；在病理條件下，特異性circRNA的表達可能出現異常，Sui等[61]采集12例孕婦分娩時的臍帶血樣本(6例唐氏綜合征胎兒、6例非唐氏綜合征胎兒)，12例兒童血液樣本(6例唐氏綜合征兒童、6例非唐氏綜合征兒童)，通過采用環狀基因芯片技術篩選臍帶血中circRNA的差異表達，共檢測到735個circRNA存在差異表達，其中414個上調，321個下調。通過逆轉錄-定量聚合酶鏈反應在兒童外周血樣本將差異性表達的circRNA進行驗證，以確定該綜合征潛在的生物標志物，同時運用Arraystar miRNA靶標預測軟件預測circRNA與相關miRNA的相互作用關系，結果顯示，分娩時唐氏綜合征胎兒臍帶血中circRNA(circRNA_103127、circRNA_103112和circRNA_104907)的表達水平顯著高于非唐氏綜合征胎兒；且3個差異表達的circRNA(circRNA_103127、circRNA_103112和circRNA_104907)分別對應3個基因(雙底物特異性酪氨酸磷酸化調節激酶A、泛素特異性蛋白酶25和精子核周RNA結合蛋白)，其中兩者僅泛素特異性蛋白酶25的表達存在顯著差異。USP25位于21q11.2區域，是一種特異性泛素蛋白酶基因，在唐氏綜合征患者中表達上調[62-63]。由此可見，唐氏綜合征患兒外周血中circRNA_103112的上調與USP25之間可能存在調控關系，其差異表達可作為一種唐氏綜合征無創性產前篩查的新的候選診斷指標。通過以人群胎兒分娩即刻的臍帶血模擬子宮內發育期血液樣本，具有一定程度的可靠性，但由于既往對泛素特異性蛋白酶25基因功能表達的研究并不充分，且存在實驗樣本數量偏少、人群代表性不足、難以對人群候選circRNA敲除或過表達等與倫理學相關實驗進行驗證等問題。因此circRNA_103112與泛素特異性蛋白酶25對唐氏綜合征患者癥狀產生的相關機制仍需進一步探討，以在更大規模人群中進行試驗或選取合適的動物模型加以驗證。

2.4circRNA與難愈性創面 傷口愈合延遲或受損是世界范圍內的主要公共衛生問題，糖尿病和高脂血癥是肥胖最常見的兩種并發癥和(或)繼發性疾病，由于多數患者血液黏度高及循環不良，傷口愈合速度普遍較慢[64]。糖尿病，尤其是2型糖尿病在65歲以上人群中的發病率逐年升高[65]。約15%的糖尿病患者傷口愈合機制受損，最常見的疾病是糖尿病足潰瘍[66]，并伴有較高的截肢率及死亡率[67]。Wang等[68]通過基因芯片對人類正常創面和糖尿病足潰瘍組織中circRNA的表達進行檢測，發現circRNA_0084443在正常創面和糖尿病足潰瘍組織中差異表達程度高。circRNA_0084443在正常創面組織中下調，但在糖尿病足潰瘍中的表達水平高于正常皮膚。在該研究中，circRNA_0084443被發現存在于人表皮角質形成細胞的胞質中，在促進角質形成細胞生長的同時，降低了細胞的活力，是角質形成細胞遷移的負調控因子。Yang等[69]對小鼠人為實驗創面傷口處circ Amotl1表達的研究發現，circ Amotl1的表達可促進成纖維細胞的增殖和遷移。circ Amotl1通過促進信號轉導及轉錄激活因子3的核轉位促進細胞增殖、存活、黏附和遷移來促進傷口修復。

肥胖是眾多疾病的病因。研究表明，許多頑固性感染性皮膚病在肥胖人群中普遍存在，其中一些疾病(如黑棘皮病、皮膚念珠菌病、體癬、毛囊炎、蜂窩組織炎和銀屑病)容易復發[70]。壓瘡、傷口愈合不良亦被認為與肥胖密切相關[71]。有學者報道，真皮內脂肪細胞可影響成纖維細胞的功能，在傷口愈合過程中起著重要作用[72]。外泌體是含有多種RNA(包括circRNA)及蛋白質、直徑在30～150 nm的小囊泡[73]。外泌體在皮膚創傷和愈合過程中具有重要作用[74]。Zhang等[75]發現，肥胖燒傷患者皮膚中脂肪來源外泌體中的circ_0075932的表達高于非肥胖患者，表明燒傷后皮膚和熱損傷的真皮角質形成細胞中circ_0075932的表達顯著上調，而高表達circ_0075932的脂肪來源外泌體可顯著促進真皮角質形成細胞的凋亡和炎癥。Pumilio RNA結合蛋白2是Pumilio RNA結合蛋白家族的成員，具有抑制翻譯及促進mRNA降解的功能[76]。在角質形成細胞中，circ_0075932可直接與Pumilio RNA結合蛋白2結合，增加其在真皮角質形成細胞中的表達，進而促進細胞的凋亡，若將Pumilio RNA結合蛋白2沉默，則circ_0075932促進細胞凋亡的作用將較大程度被抑制。

3 小 結

circRNA與整形外科疾病關系密切，相關研究仍需進一步開展。一方面，整形外科某種疾病可能涉及的circRNA數目眾多，且差異表達的circRNA之間是否存在相互作用尚不明確，如何科學比較不同circRNA在疾病中所發揮的效力，選擇相對特異度更高的circRNA作為治療靶向標志物值得進一步探索。此外，與后天性疾病相比，整形外科領域所涉及的先天性疾病的病史可追溯至胚胎或胎兒期遺傳及外界因素的干預，如何在研究circRNA與這類疾病作用關系的過程中，構思科學可行的實驗思路，設計合理的實驗方案，盡可能精確地還原疾病發病環境也考驗著臨床科研工作者。