PI3K/Akt信號通路在腎缺血再灌注損傷中的研究進展

耿男，龐燕，張靜雯，李培杰

(蘭州大學第二醫院重癥醫學科，蘭州 730030)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是住院患者常見的并發癥之一，是重癥監護病房(intensive care unit，ICU)內患者死亡的獨立危險因素，其在發達國家和發展中國家ICU的平均發病率分別為33.4%和37.7%，平均病死率則分別為40.6%和43.2%[1]。ICU內合并AKI患者的病死率較未合并AKI患者約高50%[2]。腎缺血再灌注損傷(renal ischemia-reperfusion injury，RIRI)是AKI的常見原因，其病理生理學包括氧化應激、炎癥反應、線粒體功能障礙、細胞自噬和凋亡以及內皮功能障礙等[3]。由于線粒體密度高，因此缺血再灌注損傷主要影響腎小管上皮細胞。缺血再灌注損傷是腎移植過程中不可避免的事件，可導致移植物功能延遲、重要的腎實質喪失，進而啟動免疫排斥反應，最終導致移植物功能喪失[4]。除腎移植外，缺血再灌注損傷還可繼發于其他低灌注和(或)氧合狀態疾病，包括血栓性疾病、膿毒癥、嚴重創傷、失血性休克、心搏驟停以及體外循環手術等，導致不可逆腎損傷和高病死率，已成為全球性公共衛生問題[5-6]。研究發現，RIRI時磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3 kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB/Akt)信號通路被激活，在RIRI保護中發揮重要作用[7]。現就PI3K/Akt信號通路在RIRI中的研究進展予以綜述。

1 PI3K/Akt信號通路概述

PI3K由調節亞基p85和催化亞基p110構成，主要位于胞質內，其活化依賴于p85的活化[8]。PI3K家族分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3個亞型，PI3K可通過與G蛋白偶聯受體或酪氨酸激酶受體結合激活，也可被Ras蛋白激活，活化的PI3K聚集到細胞膜上，將其底物3,4-磷脂酰肌醇二磷酸磷酸化為3,4,5-磷脂酰肌醇三磷酸，而3,4,5-磷脂酰肌醇三磷酸作為第二信使可與Akt的PH結構域結合，導致Akt構象發生改變并被募集至細胞膜，使Akt的絲氨酸磷酸化位點(Ser473)和蘇氨酸磷酸化位點(Thr308)分別被PI3K依賴激酶1和PI3K依賴激酶2磷酸化，導致Akt活化，而活化的Akt通過磷酸化下游多種底物參與細胞生存和蛋白合成等多種生物學反應[9]。PI3K/Akt信號通路是調節細胞代謝、生長、遷移和增殖的經典通路，在保護腦、心肌、腎臟、肝臟等器官的缺血再灌注損傷中發揮重要作用[10-13]。

2 PI3K/Akt信號通路在RIRI中的作用

2.1調節自噬 細胞自噬是一種溶酶體依賴的分解代謝過程，通過降解受損細胞器和錯誤折疊蛋白質在調節細胞穩態中發揮重要作用。許多體內外實驗均證實RIRI過程中自噬被激活，但自噬在細胞生存和死亡中的作用目前仍存在爭議[14-15]。體外實驗證實，Ⅲ型PI3K抑制劑3-甲基腺嘌呤和針對自噬相關蛋白Beclin1或自噬相關基因(autophagy-related gene，Atg)5轉錄物的小干擾RNA，可通過抑制自噬導致缺氧/復氧大鼠腎小管上皮細胞凋亡增加[16]。Tian等[17]發現，缺血后處理通過PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路激活自噬，減輕缺血再灌注誘導的大鼠腎臟損傷，提示自噬在腎臟氧化應激損傷中具有保護作用。同樣，高壓氧治療和缺血預處理對RIRI的保護作用也被認為與激活自噬有關[18-19]。相反，自噬過度激活可能造成自我消化和必需細胞成分降解，導致細胞損傷甚至死亡，而抑制RIRI期間的過度自噬對腎臟具有保護作用。Tan等[20]通過大鼠RIRI模型發現，腎小管上皮細胞中的Beclin-1和微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)水平升高，而重組成纖維細胞生長因子10 可通過抑制過度自噬改善AKI。利用3-甲基腺嘌呤、溶酶體抑制劑胃抑素A或針對Atg7的小干擾RNA抑制自噬，可防止過氧化氫誘導的氧化應激，從而減輕RIRI[21]。導致上述研究結論不一致的原因可能與體外研究的局限性及自噬的動態變化有關。自噬激活在RIRI早期通過清除蛋白質和受損細胞器促進細胞生存，發揮保護作用；然而，在再灌注過程中過度自噬會誘導細胞成分逐漸消耗或與凋亡級聯反應相互作用，最終導致細胞死亡。

PI3K/Akt信號通路在RIRI的自噬調節中發揮重要作用。mTOR是PI3K/Akt通路下游的重要靶點，作為自噬關鍵負性調節因子在自噬激活和早期自噬體前體結構形成中起重要作用[22]。mTOR復合物(mammalian target of rapamycin complex，mTORC)包括mTORC1和mTORC2，其中mTORC1參與細胞轉錄、翻譯和自噬等過程，并對雷帕霉素高度敏感；對雷帕霉素相對不敏感的mTORC2則參與Akt Ser473的磷酸化，并與細胞周期相關[23]。PI3K/Akt激活的mTOR調節下游自噬相關蛋白Beclin1、LC3等表達，參與自噬調節。當mTOR被抑制時，UNC-51樣激酶1復合物被激活，進一步激活PI3K復合物Ⅲ，促進囊泡核化，隨后，起源于內質網的膜結構在Atg5～Atg12和LC3Ⅱ介導下延伸、閉合形成自噬體，自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體[24]。雷帕霉素對mTORC1的抑制也可通過阻斷核糖體蛋白S6激酶和胰島素受體底物1在幾個抑制位點的磷酸化而增加Akt的磷酸化[25]，這是PI3K/Akt信號轉導負反饋機制的一部分。需要注意的是，Ⅰ型和Ⅲ型PI3K在自噬調節中發揮不同作用，Ⅰ型PI3K通過PI3K/Akt/mTORC1通路抑制自噬，而Ⅲ型PI3K通過誘導Beclin1增強自噬[26]。Beclin1是酵母Atg6蛋白產物的同系物，與Ⅲ型PI3K結合參與自噬體的形成，并進一步介導其他自噬蛋白在自噬前體膜上的定位[27]。此外，自噬與凋亡之間存在串擾，B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)/Beclin-1復合物在其中起關鍵作用，PI3K/Akt通路激活可上調Bcl-2表達，抑制Beclin-1從復合物中解離，即Beclin-1介導的自噬受Bcl-2的負調控，導致Beclin-1表達減少和自噬抑制[28]。

2.2抑制凋亡 凋亡是程序性細胞死亡，包括內在途徑[線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)、Bcl-2家族、細胞色素C和胱天蛋白酶(caspase)-9]、外在途徑(死亡受體、Fas相關死亡域蛋白和caspase-8)以及缺血性AKI期間內在與外在途徑之間的串擾。caspase在缺血再灌注誘導的腎小管上皮細胞凋亡信號轉導中起關鍵作用，外源性刺激物(如活性氧類)可導致線粒體功能障礙、mPTP開放增加，使促凋亡信號細胞色素C釋放至細胞質，激活caspase凋亡級聯反應，其中，caspase-3是凋亡的效應分子，Bcl-2和Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)可作為caspase-3的底物進一步激活下游caspase，導致caspase級聯反應放大[29]。當發生RIRI時，PI3K/Akt通路被激活，并通過其抗凋亡作用減輕腎臟損傷[30-31]。研究證實，缺氧/復氧后hk-2細胞(腎小管上皮細胞)中促凋亡因子Bax表達上調，抗凋亡因子Bcl-2表達下調，caspase-3活性顯著增加；而丹參酮可抑制缺氧/復氧誘導的hk-2細胞凋亡，且PI3K/Akt抑制劑LY294002可減弱丹參酮對hk-2細胞caspase-3活性的抑制[32]。因此，PI3K/Akt通路可能是改善RIRI的重要靶點。

PI3K/Akt通過磷酸化激活或抑制下游多個與細胞凋亡相關的蛋白家族[如Bcl-2家族、mTOR、叉頭框轉錄因子O(forkhead box O，FoxO)家族等]調節細胞凋亡。Bcl-2和Bax屬于Bcl-2家族，在細胞凋亡尤其是線粒體介導的內源性凋亡調控中發揮重要作用[33-34]。Akt未活化時，大B細胞淋巴瘤(B-cell lymphoma-extra large，Bcl-xl)/Bcl-2相關死亡啟動子(Bcl-xL/Bcl-2 associated death promoter，Bad)與Bcl-2或Bcl-xl形成復合體發揮促凋亡作用，活化的Akt磷酸化Bad的Ser136/Ser112殘基，阻斷Bad與Bcl-2或Bcl-xL形成二聚體，使其與14-3-3蛋白結合，阻止Bad發揮促凋亡作用[35]。Akt誘導的另一種促凋亡蛋白Bax磷酸化也具有負性調節作用。PI3K/Akt/mTOR通路在RIRI誘導的細胞凋亡調控中發揮一定作用。Wei等[36]發現，丙泊酚可通過激活PI3K/Akt/mTOR通路，抑制關鍵促凋亡蛋白和炎癥細胞因子的表達，保護缺血再灌注誘導的腎損傷。FoxO家族成員(包括FoxO1、FoxO2、FoxO3和FoxO4)在細胞增殖和存活中起關鍵作用，可直接被Akt磷酸化，負性調節細胞凋亡[37]。研究發現，丹參酮ⅡA磺酸鈉可通過激活PI3K/Akt/FoxO3a通路保護大鼠心臟免受缺血再灌注損傷[38]。Akt可活化并抑制FoxO3a向細胞核易位，促進細胞存活，這與細胞死亡誘導蛋白(如Fas配體)的轉錄有關[39]。此外，Akt的下游靶點糖原合成酶激酶3β通過Ser9磷酸化而失活，磷酸化的糖原合成酶激酶3β與mPTP亞單位結合，增加mPTP開放閾值，抑制mPTP開放及細胞色素C釋放[40]。髓樣細胞白血病1是糖原合成酶激酶3β在線粒體上作用的主要底物，通過與Bcl-2家族的促凋亡蛋白形成異源二聚體，調控線粒體依賴途徑的細胞凋亡[41]。

2.3減輕氧化應激 腎臟缺血再灌注過程中產生大量活性氧類，導致氧化/抗氧化失衡而產生氧化應激。氧化應激通過誘導蛋白質和多糖變性、降解以及脂質過氧化、DNA損傷等造成細胞損傷，也可誘導細胞凋亡，是缺血再灌注損傷的重要原因[42]。同時，抗氧化酶(過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等)下調也可能與缺血再灌注的發病機制有關。因此，抑制氧化應激或防止自由基產生是RIRI期間保護腎臟損傷的重要策略。PI3K/Akt通路不僅是誘導hk-2細胞活性的途徑，還調節腎組織的氧化應激。

核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)作為PI3K/Akt通路的下游靶標，是參與內源性抗氧化的主要調節因子和氧化應激期間釋放的關鍵轉錄因子[43]。Nrf2通常與Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1形成多聚體，當受到內源性或外源性刺激時，Nrf2通過Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1依賴或獨立的方式釋放，易位至細胞核并與抗氧化反應元件結合，從而上調下游Ⅱ期酶基因(如血紅素加氧酶-1和醌氧化還原酶-1)的表達[44-45]。因此，激活PI3K/Akt/Nrf2通路可抑制氧化應激并在缺血再灌注損傷中發揮保護作用。實際上，Nrf2激活也可以通過其他途徑(如促分裂原活化的蛋白激酶和蛋白激酶C)來調節[46]。Zhang等[47]通過小鼠缺血再灌注模型發現，Tempol可通過PI3K/Akt/Nrf2(而非蛋白激酶C/Nrf2)通路有效減輕缺血再灌注誘導小鼠的腎損傷。

此外，活性氧類、凋亡與內質網應激密切相關，氧化應激和內質網應激介導的細胞凋亡在缺血再灌注損傷的發展中起重要作用。Tan等[48]發現，堿性成纖維細胞生長因子2可通過激活PI3K/Akt信號通路抑制過度的內質網應激，減輕缺血再灌注誘導的腎小管上皮細胞凋亡。Liu等[49]研究證實，缺氧/復氧可誘導溴結構域蛋白4水平上調，介導氧化應激、細胞凋亡和內質網應激，而溴結構域蛋白4抑制劑可通過PI3K/Akt通路阻止FoxO4依賴的活性氧產生，阻斷腎臟凋亡和內質網應激相關蛋白葡萄糖調節蛋白78、C/EBP同源蛋白等的表達，在RIRI中發揮保護作用。內質網應激通過C/EBP同源蛋白誘導缺血再灌注后的細胞凋亡，而C/EBP同源蛋白介導的細胞凋亡與Bcl-2水平下調和Bax易位相關[50]。需要注意的是，caspase-12被認為是內質網應激誘導凋亡的關鍵因子，可從內質網轉運到細胞質中，激活caspase-3啟動凋亡，這與線粒體和死亡受體介導的凋亡途徑不同[51]。

2.4調節內皮功能障礙 內皮功能障礙是腎小管上皮損傷始發和持續的重要因素，參與RIRI的發病機制。一氧化氮(nitric oxide，NO)是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化L-精氨酸生成的神經遞質。NO合成障礙可能導致腎血流量減少，增加腎血管阻力和內皮素-1表達，而高表達的內皮素-1可通過蛋白激酶C依賴途徑損傷內皮細胞NO的生成[52]。研究發現，內皮素-1缺乏不僅可減輕缺血再灌注引起的近端腎小管損傷，還可減輕炎癥和氧化應激反應[53]。根據來源不同，NOS可分為神經型NOS、內皮型NOS和誘導型NOS。神經型NOS主要存在于神經系統，在致密斑、近曲小管、遠曲小管和集合管中也有表達[54]。誘導型NOS主要存在于巨噬細胞中，參與炎癥反應，誘導型NOS上調可導致腎損傷[55]。內皮型NOS主要存在于腎小管上皮細胞和血管內皮細胞中，參與腎血管痙攣的預防和炎癥細胞浸潤的減少，是調節內皮源性NO產生的關鍵酶[56]。PI3K/Akt通路是調控內皮型NOS磷酸化的關鍵通路之一，PI3K/Akt通路阻斷可抑制部分內皮型NOS的活性。缺血再灌注損傷后，腎組織中的NO水平升高，而內皮型NOS水平則顯著降低，表明誘導型NOS和神經型NOS上調產生的高水平NO可誘導細胞損傷或死亡，但內皮型NOS產生的NO被認為是抗RIRI的保護因素，可通過PI3K/Akt/內皮型NOS途徑發揮腎臟缺血再灌注保護作用[57]。

2.5抑制炎癥反應 炎癥反應與缺血再灌注引起的AKI有關，一方面，炎癥細胞因子[如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素(interleukin，IL)-6等]在缺血再灌注誘導的AKI中上調，并在近端腎小管上皮細胞產生多種損傷性變化[58-59]。另一方面，腎缺血再灌注誘導的炎癥反應有助于內皮激活和損傷，促進內皮細胞-白細胞黏附，觸發白細胞滯留并損害微血管血流[60]，誘導血管功能障礙和血栓形成。TNF-α還可通過抗體依賴性細胞介導的細胞毒性增強中性粒細胞的吞噬作用，促進中性粒細胞附著于血管內皮細胞，誘導自由基產生與細胞凋亡，導致局部炎癥反應激活，加重腎損傷[61]。激活PI3K/Akt信號轉導通路可抑制缺血再灌注誘導的IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子表達，改善RIRI，但具體機制目前尚不明確[62]。缺血再灌注可刺激受損組織釋放或表達內源性Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)配體，特別是TLR2和TLR4的配體，包括高遷移率族蛋白B1。腎臟缺血再灌注后，高遷移率族蛋白B1從核易位到近端腎小管細胞的細胞質中，并在細胞外釋放，加重腎損傷[63]。

核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)是一種重要的核轉錄因子，可誘導多種炎癥細胞因子(如TNF-α和IL-1β)表達。低氧可直接誘導腎臟系統中NF-κB活化，導致缺血期間炎癥介質的產生。PI3K/Akt通路在調節RIRI的NF-κB的激活中發揮重要作用，通過抑制促炎細胞因子發揮對RIRI的保護作用。研究證實，蛇床子素預處理可通過激活PI3K/Akt通路抑制NF-κB活化，下調炎癥因子表達，從而改善RIRI[64]。但蛇床子素也可能通過PI3K/Akt以外的其他途徑抑制NF-κB的激活，如促分裂原活化的蛋白激酶通路[65]。另外，PI3K/Akt/mTOR信號通路亦與缺血再灌注誘導的炎癥反應有關。Kezic等[66]通過小鼠模型發現，RIRI時抑制mTOR可能激活NF-κB，刺激NF-κB驅動的促炎細胞因子產生。此外，NF-κB還可被TLR/IL-1受體通路激活，導致促炎癥介質釋放。有研究表明，TLR和PI3K/Akt信號通路之間存在串擾，PI3K/Akt信號級聯反應通過抑制促炎細胞因子的產生和凋亡對缺血再灌注損傷起保護作用[67]。因此，PI3K/Akt軸是TLR4信號的負調控通路，因為其可抑制NF-κB的活化及其下游促炎細胞因子的釋放。

3 小 結

RIRI整體機制復雜，涉及不同分子通路之間的相互作用。PI3K/Akt通路在RIRI的發生、發展中具有重要作用，可通過調節氧化應激、炎癥反應以及細胞凋亡和自噬等發揮保護作用。深入研究RIRI的發病機制，尤其是PI3K/Akt通路下游的多種分子機制意義重大。腎纖維化是終末期腎臟疾病的主要原因，腎缺血再灌注可導致纖維化并發展為慢性腎臟疾病，而上皮-間充質轉化在纖維化的發病中起關鍵作用。抑制PI3K/Akt通路可抑制腎臟缺血再灌注誘導的腎小管上皮細胞向間充質細胞轉化，從而減輕腎纖維化[68]。此外，補體系統激活也參與了RIRI的發病機制。靶向補體抑制因子可通過誘導PI3K/Akt活化，抑制缺血再灌注誘導的細胞凋亡，改善細胞因子表達失調，發揮腎臟保護作用[69]。因此，進一步研究PI3K/Akt通路在先天免疫中的獨特作用以及對RIRI后腎纖維化及慢性腎臟疾病的影響均具有重要意義。