中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成機(jī)制及其在肝臟疾病中的作用

劉瀟，張珊，陳文慧，張雯婷，段旭冰，張玉蓉，徐連潔

(云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，昆明 650000)

中性粒細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞之一，具有多種免疫功能，如吞噬、脫顆粒、產(chǎn)生活性氧類(reactive oxygen species，ROS)以及形成和釋放中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)[1]。1996年，Takei等[2]使用佛波酯最大限度地激活中性粒細(xì)胞，觀察到中性粒細(xì)胞的分葉狀核解聚、核膜破裂、細(xì)胞質(zhì)中染色質(zhì)積聚、細(xì)胞膜破裂，這一過程不同于凋亡或壞死，但未能明確解釋該中性粒細(xì)胞死亡方式。2004年，Brinkmann等[3]進(jìn)一步證明了這種新的中性粒細(xì)胞死亡機(jī)制(即NETs)，它是一種能夠?qū)苟拘砸蜃雍蜌缂?xì)菌的胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，主要由解聚DNA的胞外鏈以及中性粒細(xì)胞顆粒蛋白組成，這些蛋白包括組蛋白、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、組織蛋白酶G、白細(xì)胞蛋白酶3(leukocyte proteinase 3，PR3)等30多種蛋白和酶組成[4]。雖然NETs可以捕殺細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲，可防止細(xì)菌和真菌播散并對抗嚴(yán)重感染[5]，但NETs的過度形成會導(dǎo)致炎癥的惡化、自身免疫性疾病的發(fā)生、癌癥和血栓的形成等[6-7]。因此，NETs也被認(rèn)為是引起多種疾病的潛在因素，除在心血管疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)[8-9]等疾病中的作用外，NETs還參與了自身免疫性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝細(xì)胞癌等多種慢性肝病的發(fā)病機(jī)制，并在其中起到關(guān)鍵作用[10]。現(xiàn)就NETs的形成機(jī)制及其在肝臟疾病中的作用予以綜述，以為肝病的診療提供新的思路。

1 NETs的形成機(jī)制

NETs的形成機(jī)制可大致分為晚期溶解性和早期非溶解性[11]。溶解性和非溶解性NETs結(jié)構(gòu)的形成是中性粒細(xì)胞活化的結(jié)果。中性粒細(xì)胞的活化依賴于許多不同受體對感染性刺激和(或)無菌刺激的識別，包括Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)、Fc受體、補(bǔ)體受體、復(fù)合受體及其他受體等。

1.1溶解性NETs的形成 溶解性NETs的形成包括氧化依賴性和非氧化依賴性途徑。由于各種刺激，Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放到胞質(zhì)中[12]，通過還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶復(fù)合物產(chǎn)生ROS，激活蛋白激酶C或Raf-促分裂原活化的蛋白激酶激酶-胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路，致使溶解性NETs的形成，這屬于氧化依賴性途徑[13]。另外，也有很多NETs的形成與氧化劑無關(guān)，如V-組跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域包含物1可在不受氧化劑影響的情況下參與NETs形成的特異性信號通路[14]。此外，活化的精氨酸脫亞氨酶4(protein arginine deaminase 4，PAD4)誘導(dǎo)細(xì)胞核中的組蛋白3形成瓜氨酸化組蛋白3，進(jìn)而促進(jìn)染色質(zhì)解聚釋放至胞外而形成NETs[15]。MPO依賴NE進(jìn)入細(xì)胞核[16]并促進(jìn)染色質(zhì)進(jìn)一步解聚[17]，核膜被降解，解聚的染色質(zhì)釋放到胞質(zhì)中，被顆粒和胞質(zhì)蛋白修飾，隨后釋放至細(xì)胞外。這一過程在形態(tài)上不同于細(xì)胞壞死(其中核膜和顆粒保持完整)和凋亡(其中核濃縮和胞質(zhì)空泡化發(fā)生)。

1.2非溶解性NETs的形成 與溶解性NETs的形成不同，非溶解性NETs的形成不依賴于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶途徑的快速形成[18]。金黃色葡萄球菌或白色念珠菌在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)的非溶解性NETs的形成需要TLR和(或)補(bǔ)體受體4[19]。體內(nèi)存在的TLR配體或某些細(xì)菌株通過直接刺激血小板與中性粒細(xì)胞結(jié)合，促進(jìn)非溶解性NETs的形成[20]。中性粒細(xì)胞和血小板之間的相互作用依賴于β2整合素和中性粒細(xì)胞上的淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1等[21]。在非溶解性NETs的形成過程中，PAD4的激活促使染色質(zhì)解聚，并使NE向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)，被蛋白修飾的染色質(zhì)通過核膜囊泡出口排出而不破壞細(xì)胞膜[22]，而中性粒細(xì)胞在NETs形成后仍保持著爬行、趨化、吞噬、產(chǎn)生ROS和殺死攝入的病原體的能力[23]。但目前對非溶解性NETs的形成研究還相對較少。

2 NETs在肝臟及肝臟疾病中的作用

2.1NETs與肝內(nèi)病原菌感染 及時(shí)清除血液循環(huán)中的細(xì)菌是先天免疫系統(tǒng)的首要任務(wù)。肝臟作為人體的重要器官，可清除循環(huán)中的大多數(shù)細(xì)菌。將細(xì)菌注射到膿毒癥小鼠模型血液中的研究發(fā)現(xiàn)，注射后10 min以內(nèi)超過60%的細(xì)菌會迅速進(jìn)入肝臟并被肝臟隔離，證明了肝臟具有清除細(xì)菌的作用[24]。肝臟中有助于捕獲病原菌的兩個(gè)關(guān)鍵免疫細(xì)胞是庫普弗細(xì)胞和中性粒細(xì)胞[25]。庫普弗細(xì)胞是肝竇中的巨噬細(xì)胞，在抗菌防御中起關(guān)鍵作用。Zeng等[26]構(gòu)建感染金黃色葡萄球菌小鼠模型，利用活體成像技術(shù)觀察小鼠體內(nèi)庫普弗細(xì)胞捕獲細(xì)菌的情況發(fā)現(xiàn)，在靜脈注射細(xì)菌后5 min內(nèi)約70%的細(xì)菌會被庫普弗細(xì)胞迅速隔離，此過程依賴于庫普弗細(xì)胞的補(bǔ)體免疫球蛋白超家族受體(complement receptor of the immunoglobulin superfamily，CRIg)識別脂磷壁酸直接結(jié)合金黃色葡萄球菌，從而捕捉和清除細(xì)菌，表明庫普弗細(xì)胞能夠通過CRIg直接捕殺循環(huán)系統(tǒng)中的細(xì)菌。且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲除CRIg基因小鼠或缺乏庫普弗細(xì)胞小鼠更易感染細(xì)菌[27]。

盡管庫普弗細(xì)胞在抗菌防御中起著關(guān)鍵作用，但在某些情況下，捕獲細(xì)菌后的庫普弗細(xì)胞也會成為潛在的病原體[28]，而中性粒細(xì)胞釋放的NETs可阻止被感染的庫普弗細(xì)胞的逃逸。由于中性粒細(xì)胞缺乏CRIg受體，不能直接捕獲血液中的細(xì)菌，但其可通過釋放NETs直接捕獲并殺死細(xì)菌。McDonald等[29]通過使用多通道轉(zhuǎn)盤式共聚焦顯微鏡對葡萄球菌引起的膿毒癥小鼠模型進(jìn)行活體成像分析發(fā)現(xiàn)，肝臟中形成的NETs可有效清除細(xì)菌，使肝臟攝取細(xì)菌的能力提高4倍，且肝臟微循環(huán)中NETs的產(chǎn)生依賴于血小板-中性粒細(xì)胞的相互作用。隨后，McDonald等[30]采用脂多糖刺激TLR4基因敲除小鼠，應(yīng)用活體免疫熒光成像觀察小鼠竇內(nèi)皮細(xì)胞活化，進(jìn)而誘導(dǎo)血源性透明質(zhì)酸相關(guān)蛋白在竇內(nèi)沉積，血源性透明質(zhì)酸相關(guān)蛋白結(jié)合CD44誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞在肝竇內(nèi)黏附，進(jìn)一步促進(jìn)肝臟中NETs的釋放，以清除細(xì)菌。另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NETs的形成可降低機(jī)體的病毒感染率，Jenne等[31]對靜脈注射痘病毒小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)血小板減少，中性粒細(xì)胞和血小板重新聚集到肝血管系統(tǒng)，通過促進(jìn)NETs釋放來保護(hù)宿主細(xì)胞免受痘病毒的感染，結(jié)果表明NETs在預(yù)防病毒感染方面也具有重要的作用。而肝臟中NETs的明顯積聚可能與血管性血友病因子表達(dá)水平過高有關(guān)，因?yàn)檠苄匝巡∫蜃雍徒M蛋白之間存在高度特異性的受體-配體相互作用[32]，肝竇中血管性血友病因子表達(dá)增高，使NETs在肝臟滯留，而不會附著在其他器官的血管上。

綜上所述，當(dāng)病原菌感染機(jī)體后，肝臟中的庫普弗細(xì)胞可捕獲并吞噬細(xì)菌，但細(xì)菌可在庫普弗細(xì)胞內(nèi)存活并產(chǎn)生細(xì)胞溶解分子，使庫普弗細(xì)胞裂解，從而造成細(xì)菌逃逸。但被感染的庫普弗細(xì)胞若被中性粒細(xì)胞釋放的NETs包圍，則可阻止細(xì)菌的逃逸和播散入血。肝臟中的庫普弗細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及NETs通過上述作用共同消滅血液中傳播的細(xì)菌，發(fā)揮肝臟清除細(xì)菌的作用。

2.2NETs與自身免疫性肝病 自身免疫性肝病是自身免疫功能紊亂導(dǎo)致的非傳染性慢性進(jìn)行性肝臟炎癥疾病，包括自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)、原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis，PBC)和原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis，PSC)[33]?？筛鶕?jù)抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)和抗平滑肌抗體將AIH分為1型AIH[ANA和(或)抗平滑肌抗體陽性]和2型AIH(肝-腎微粒體1型抗體或肝細(xì)胞溶膠1型抗體陽性)兩類[34]。雖然AIH中產(chǎn)生ANA的機(jī)制尚不明確，但AIH中的抗DNA、抗組蛋白、抗著絲粒、抗染色質(zhì)、抗核糖核蛋白和抗細(xì)胞周期蛋白A參與了ANA反應(yīng)[35]，而染色質(zhì)、組蛋白和DNA均為NETs的成分，提示ANA與NETs形成有關(guān)[36]?？咕€粒體自身抗體是PBC的血清學(xué)標(biāo)志，具有高度特異性[37]，ANA也是PBC的診斷標(biāo)記[38]。PSC患者血清中存在多種自身抗體，但均無疾病特異性。Hov等[39]通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，94%的PSC患者可檢測到抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)，并采用間接免疫熒光法對241例PSC患者進(jìn)行ANCA檢測，結(jié)果顯示ANCA陽性率達(dá)80%，且ANAC可識別具有特殊臨床和遺傳特征的PSC患者，提示ANCA可作為PSC的潛在血清學(xué)標(biāo)志。PR3是中性粒細(xì)胞胞質(zhì)中的一種絲氨酸蛋白酶，PR3-ANCA是自身免疫性肝病的一種特殊生物標(biāo)志物，PSC患者的PR3-ANCA比例較AIH和PBC等其他肝病患者高[40]。PSC患者中PR3-ANCA與肝酶水平升高相關(guān)，表明持續(xù)釋放PR3可導(dǎo)致疾病發(fā)病的增加。

雖然自身免疫性肝病產(chǎn)生NETs的機(jī)制尚不明確，但疾病早期階段的中性粒細(xì)胞浸潤以及普遍存在的中性粒細(xì)胞胞內(nèi)蛋白的自身抗體均提示NETs的形成參與了自身免疫性肝病發(fā)生過程，這可能為今后治療和診斷自身免疫性肝病提供新的方向。

2.3NETs與NASH NASH是一種進(jìn)行性、炎癥性脂肪肝病，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。除遺傳和代謝因素外，先天免疫激活在NASH炎癥進(jìn)展中起著重要作用[41]。中性粒細(xì)胞作為天然免疫的效應(yīng)細(xì)胞，可分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，進(jìn)而招募其他效應(yīng)細(xì)胞浸潤肝臟，促使NASH發(fā)展。此外，中性粒細(xì)胞還可分泌多種蛋白酶對組織造成損傷，如MPO、NE。Pulli等[42]采用蛋氨酸膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)NASH小鼠模型發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞明顯增多并分泌大量的MPO，MPO通過增加膽固醇在肝臟的蓄積、促進(jìn)炎癥與纖維化發(fā)展、引起氧化應(yīng)激進(jìn)一步激活轉(zhuǎn)化生長因子-β和肝星狀細(xì)胞，肝星狀細(xì)胞反過來分泌CXC趨化因子配體1，從而促使NASH的發(fā)展，提示MPO是NASH促凋亡和促纖維化進(jìn)展途徑的一部分，也是改善NASH的潛在治療靶點(diǎn)。同時(shí)，Rensen等[43]通過對敲除MPO基因NASH小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，MPO缺乏可顯著降低肝星狀細(xì)胞活化、纖維化和肝細(xì)胞損傷，從而延緩NASH的進(jìn)程，證實(shí)了MPO促進(jìn)NASH疾病進(jìn)展，同時(shí)也反映了NETs在NASH發(fā)病機(jī)制中的重要作用。Chen等[44]通過對敲除NE基因小鼠和野生型小鼠建立的NASH模型進(jìn)行研究，結(jié)果表明NASH小鼠肝臟組織中NE的表達(dá)量增加，敲除NE基因可改善小鼠的體重、血脂紊亂情況，并下調(diào)炎癥反應(yīng)，且NE在體內(nèi)和體外均具有調(diào)節(jié)肝臟神經(jīng)酰胺代謝的作用，提示中性粒細(xì)胞通過NE在NASH中發(fā)揮促進(jìn)炎癥進(jìn)展的作用。此外，臧淑妃等[45]的研究顯示，NE抑制劑Sivelestat可明顯降低NASH小鼠肝臟脂肪變性和炎癥反應(yīng)程度，表明NE抑制劑Sivelestat對NASH具有防治作用，為NE抑制劑作為NASH防治藥物提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。van der Windt等[46]通過檢測發(fā)現(xiàn)，NASH患者血清NETs標(biāo)志物MPO-DNA的表達(dá)水平升高，并發(fā)現(xiàn)抑制NASH-肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)模型小鼠NETs的形成可減少巨噬細(xì)胞浸潤、炎癥細(xì)胞因子的釋放，減輕NASH的炎癥進(jìn)展并降低NASH向HCC的發(fā)展，表明NETs在NASH進(jìn)展中的重要作用。NETs通過其組成成分參與了NASH疾病發(fā)展過程，故推測NETs可作為NASH治療及診斷的重要靶點(diǎn)，但目前關(guān)于NETs影響NASH進(jìn)展的相關(guān)報(bào)道較少。

2.4NETs與HCC HCC是我國常見的惡性腫瘤之一。中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值升高可作為多種腫瘤預(yù)后不良的指標(biāo)[47-49]。NETs與HCC的發(fā)展密切相關(guān)，van der Windt等[46]采用鏈脲佐菌素與高脂飼料誘導(dǎo)NASH-HCC模型小鼠，20周時(shí)所有雄性小鼠肝表面大量癌細(xì)胞聚集，經(jīng)DNase給藥或敲除PAD4基因抑制NETs形成后，肝表面癌細(xì)胞的大小和數(shù)量顯著減少，提示NETs具有促進(jìn)HCC發(fā)展的作用。此外，Yang等[50]發(fā)現(xiàn)，與健康者相比，HCC患者血清NETs標(biāo)志物MPO-DNA水平升高，且轉(zhuǎn)移性肝癌患者更顯著；并通過體外研究證實(shí)，NETs表達(dá)水平的升高可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性和侵襲力，NETs通過上調(diào)環(huán)加氧酶2誘導(dǎo)HCC細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，從而激活TLR4/9信號通路，使肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，提示NETs可促進(jìn)腫瘤炎癥反應(yīng)以及肝癌轉(zhuǎn)移。

雖然NETs浸潤在原發(fā)性腫瘤中很少被檢測到，但在某些肝癌、肺癌、骨腫瘤和腦腫瘤等轉(zhuǎn)移性病變中很容易發(fā)現(xiàn)。其中，NETs浸潤在肝轉(zhuǎn)移表現(xiàn)中最豐富。在肺癌[51]、結(jié)腸癌[52]等小鼠模型中，NETs的形成可導(dǎo)致手術(shù)應(yīng)激后癌細(xì)胞的肝轉(zhuǎn)移。最近研究發(fā)現(xiàn)，NETs在乳腺癌和結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移患者中的表達(dá)量較高，血清NETs水平可作為預(yù)測早期乳腺癌肝轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)志，為了進(jìn)一步探討NETs在體內(nèi)肝轉(zhuǎn)移形成中的作用，通過將E0771腫瘤細(xì)胞注射到缺乏PAD4的C57BL/6小鼠脾臟的研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，缺乏PAD4基因小鼠的肝轉(zhuǎn)移明顯減輕；然后向小鼠注射缺乏CCDC25的癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，肝轉(zhuǎn)移瘤的形成受到抑制，表明NETs可通過跨膜蛋白CCDC25促進(jìn)腫瘤肝轉(zhuǎn)移[53-54]。

此外，NETs還可通過以下機(jī)制使癌細(xì)胞向肝轉(zhuǎn)移擴(kuò)散[55]，首先，NETs通過與細(xì)胞外DNA的相互作用捕獲循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)肝臟微循環(huán)內(nèi)癌細(xì)胞的早期黏附、遷移和侵襲。其次，血管內(nèi)NETs的形成可破壞內(nèi)皮的完整性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞從循環(huán)中外滲。最后，術(shù)后應(yīng)激或感染可誘導(dǎo)血小板活化，血小板與NETs結(jié)合后共同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的黏附和侵襲。總之，NETs雖然是中性粒細(xì)胞捕獲和殺死病原體的一種新作用機(jī)制，但在癌癥進(jìn)展中表現(xiàn)出更多的促進(jìn)腫瘤發(fā)展及癌轉(zhuǎn)移的作用，因此抑制NETs的形成可作為一種潛在的抗轉(zhuǎn)移治療策略。

3 結(jié) 語

中性粒細(xì)胞釋放和形成NETs有助于消除病原體，對抗嚴(yán)重感染。但NETs的過度形成是多種疾病的致病因素，尤其在自身免疫性肝病、NASH、HCC等肝臟疾病的病程進(jìn)展中，NETs發(fā)揮著重要的作用。目前，NETs的研究仍是一個(gè)相對新興的領(lǐng)域，需要進(jìn)一步探索，包括NETs在疾病中的形成機(jī)制、抑制NETs的有效手段以及NETs檢測技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化等。NETs及相關(guān)分子可作為潛力生物標(biāo)志物，為肝臟相關(guān)疾病的治療與干預(yù)提供新的方向。