蛋白質O-GlcNAc修飾對缺血再灌注損傷保護機制的研究進展

吳科帆，江夢，夏中元

(武漢大學人民醫院麻醉科，武漢 430060)

蛋白質作為人類生命物質的基礎，需要翻譯合成后在內質網和高爾基體上進行翻譯后加工才能表達出活性，目前已知的加工類型包括二硫鍵的形成、化學修飾和剪切等，蛋白質翻譯后還會與其他的生物化學官能團結合，使蛋白質產生更多的功能來滿足細胞的各項需求。與蛋白質的磷酸化和醋酸化類似，蛋白質的氧連-N-乙酰葡糖胺(O-linked-N-acetylglucosamine，O-GlcNAc)修飾是蛋白質轉錄和翻譯后產生的一種特殊蛋白質修飾方式，也是唯一發生在細胞內的參與細胞信號轉導的糖修飾，其對蛋白質的定位、功能、活性都產生了重要影響。自20世紀80年代蛋白質的O-GlcNAc修飾發現以來，質譜技術的發展和生物檢測手段的提高使研究人員對蛋白質的O-GlcNAc修飾水平的調控有了新的認識，因此，蛋白質的O-GlcNAc修飾成為一種不容忽視的細胞信號的調節手段。

隨著人類對缺血性相關疾病的日益重視，提高缺血再灌注損傷患者的治療與后期康復水平成為當前臨床的重大難題之一，近年來缺血再灌注損傷也成為研究熱點。研究表明，重要器官的缺血再灌注損傷與靶器官細胞水平的鈣超載、線粒體損傷、全身炎癥反應以及氧化應激等因素存在一定的相關性[1]。由于蛋白質O-GlcNAc修飾對細胞內環境的變化非常敏感，在缺血再灌注損傷狀態下，細胞內的O-GlcNAc水平在很大程度上出現上調，并激活相應的細胞信號級聯通路，因此研究者將蛋白質的O-GlcNAc修飾與缺血再灌注損傷的各種途徑聯系起來發現，上調的蛋白質O-GlcNAc修飾水平可以參與調控細胞內環境的改變，并對損傷做出反應，從而增強細胞應對缺血再灌注損傷的能力。現就缺血再灌注損傷的發生發展環節中被蛋白質O-GlcNAc修飾的關鍵蛋白，以及這些關鍵蛋白的O-GlcNAc修飾水平變化所導致的細胞應激能力變化的主要方式做一介紹，并對蛋白質O-GlcNAc修飾對缺血再灌注損傷保護機制的研究進展予以綜述，以期為后期的基礎研究和臨床治療提供參考和思路。

1 蛋白質O-GlcNAc修飾簡介

細胞中有大約5%的葡萄糖通量進入己糖胺途徑(hexosamine biosynthesis pathway，HBP)。HBP分為4個關鍵步驟，最終將果糖-6磷酸鹽轉化為尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(uridine 5′-diphosphate-N-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc)，UDP-GlcNAc作為O-GlcNAc的底物生成N-glcnac，在O-GlcNAc轉換酶的作用下通過糖苷鍵連接到絲氨酸或蘇氨酸(Ser/Thr)羥基上，進而調節蛋白質的功能。

蛋白質O-GlcNAc修飾是細胞質和細胞核內參與細胞信號調節糖修飾的唯一方式，O-GlcNAc修飾可以改變特定蛋白質在細胞內的位置，使該特定蛋白質轉移到其他細胞器產生作用。經O-GlcNAc修飾后的蛋白質也表現出不同的功能，如改變修飾后的蛋白質可與DNA雙鏈特異結合，在轉錄水平調控細胞的應激狀態。O-GlcNAc修飾還可以直接改變蛋白質的活性以及蛋白質的半衰期，影響該蛋白質的作用時間和功能。上述各種改變作為一種廣泛動態的蛋白質修飾現象參與細胞應激狀態下的各種細胞信號轉導，起到十分重要的應激作用[2-4]。

2 O-GlcNAc調控手段

蛋白質的O-GlcNAc修飾通過多種途徑參與調控重要器官的缺血再灌注損傷，為了進一步明確糖基化修飾蛋白的種類和對該蛋白質調控的具體手段，需要開展更多關于蛋白質O-GlcNAc修飾途徑的相關研究。近年來，越來越多的特異性調控手段被發現，這些調控手段為O-GlcNAc修飾的研究提供了新的思路，并為治療缺血再灌注損傷的研究提供了新方向。

2.1HBP限速酶 谷氨酰胺果糖-6-磷酸鹽中轉移酶(glutamine-fructose-6-phosphate aminotransferase，GFAT)是HBP的第一個限速酶，GFAT以兩種不同的形式在人體不同的組織和器官中表達并發揮作用，在轉錄和翻譯水平均受到UDP-GlcNAc反饋抑制的調節。GFAT1在胰腺、胎盤、睪丸和骨骼肌中表達；GFAT2在心臟和中樞神經系統中表達。有研究發現，秀麗隱桿線蟲中的GFAT1的水平上調，蟲體中的蛋白質平衡改善，壽命延長[5]。有研究報道，UDP-GlcNAc對細胞中的GFAT有負反饋調節作用[6]。目前研究常用的GFAT拮抗劑為O-二乙酰-L-血清素(阿澤林)和6-二氮-5-氧化酶，這兩種拮抗劑對GFAT的抑制不可逆轉，導致細胞分配到HBP途徑的葡萄糖減少。

細胞體內其他營養物質(如谷氨酰胺、乙酰CoA和葡萄糖胺)的代謝都可以通過與葡萄糖代謝有關的途徑(氨基酸代謝、脂質代謝、葡萄糖氧化等)進入HBP，進而參與UDP-GlcNAc的合成。值得注意的是，由于UDP-GlcNAc的合成需要其他代謝途徑的參與，因此O-GlcNAc細胞化也可作為細胞代謝的感應器[7-8]。

2.2O-GlcNAc轉移酶(O-linked GlcNAc transferase，OGT)和O-GlcNAc水解酶(O-GlcNAcase，OGA) 在底物UDP-GlcNAc特定的情況下，細胞內蛋白質O-GlcNAc修飾水平受到OGT和OGA的調節。因此，通過激活劑和抑制劑調節OGT或OGA的活動可調節細胞內蛋白質的O-GlcNAc水平。雖然OGT可同時受到磷酸化和糖基化的影響，但迄今為止，尚沒有提高OGT活性的具體藥理方法。

OGA主要存在于細胞質中，在細胞核和線粒體中亦存在OGA，OGA催化可去除蛋白質的O-GlcNAc修飾。目前已開發的用于O-GlcNAc生物作用研究的OGA抑制劑包括PUGNAc、GlcNAc statin和Thiamet G，均可有效限制OGA的活性。有研究表明，Thiamet G的神經保護作用與微膠質/巨噬細胞極化的變化和核因子κB/p65信號的抑制有關[9]。此外，PUGNAc是OGA的一種強有力的競爭抑制劑，已被廣泛用于提高O-GlcNAc水平，重要灌注器官缺血再灌注損傷中葡萄糖胺治療所提高的細胞蛋白O-GlcNAc修飾水平可以被PUGNAc模仿。然而，PUGNAc不是一種特異性OGA抑制劑(抑制常數KI=0.046 mmol/L)；其還抑制了其他糖苷水解酶，如溶酶體β-六角辛酸酶(KI=0.036 μmmol/L)和β-N-乙酰糖苷酶(KI=6 μmmol/L)。PUGNAc還會導致細胞培養的多種細胞系狀態不佳。因此，PUGNAc作為抑制劑的作用并非單一的抑制蛋白質的糖基化修飾，其產生的細胞結局存在差異性，甚至會影響蛋白質O-GlcNAc對細胞的保護作用，降低其潛在的治療價值。近期研究發現了新的NAG-thiazoline(NAG噻唑啉)衍生物NAG-Bt和NAG-Ae，其OGA的選擇性明顯高于PUGNAc，這兩種OGA抑制劑具有明顯的心臟保護作用，如促進心臟功能恢復、減少組織損傷以及降低缺血在再灌注后心律失常的發生率[10]。

2.3內質網應激產物上調HBP通量 缺血再灌注損傷所造成的廣泛的細胞應激狀態使細胞內質網上的錯誤折疊和未折疊的蛋白質累積，最終導致內質網應激，內質網應激的3條途徑促使細胞對蛋白折疊能力的系統恢復，細胞立即停止翻譯并激活基因程序加強蛋白質的折疊和加工，激活內質網相關蛋白降解去除內質網上的錯誤蛋白。其中，需肌醇酶1途徑剪切X盒結合蛋白1信使RNA的編碼區，使其發生框移位變，從而表達新的產物——剪切過的X盒結合蛋白1，剪切過的X盒結合蛋白1是一類具有高度活性的轉錄子，在心肌細胞中激活GFAT1的表達，能夠明顯上調HBP通量，從而上調UDP-GlcNAc水平，上述途徑在缺血再灌注損傷及多種細胞應激條件下均可被激活，使細胞O-GlcNAc修飾水平上調，提高細胞的生存能力。剪切過的X盒結合蛋白1在轉錄翻譯水平將內質網應激與蛋白質O-GlcNAc修飾聯系起來，促進細胞的生存[11-12]。

2.4miR-24下調O-GlcNAc水平 近年來，微RNA(microRNA，miRNA)作為天然存在的非編碼調節分子逐漸受到關注，20～30個長度的核苷酸的miRNA特異性表達和細胞凋亡與衰老密切相關。通過測定miR-24在心肌缺血再灌注損傷中的潛在靶點，發現了蛋白質的O-GlcNAc連接酶——OGT[13]。在細胞內水平，miR-24與O-GlcNAc連接酶呈負相關，對O-GlcNAc修飾的負性調節的研究顯示，通過提高腫瘤細胞中的miR-24水平、降低腫瘤細胞中蛋白質O-GlcNAc水平，可降低腫瘤向周圍組織的侵襲能力[14]。

3 O-GlcNAc修飾參與缺血再灌注損傷發生發展過程

3.1O-GlcNAc與鈣超載 目前，蛋白質的O-GlcNAc修飾對重要灌注器官的缺血再灌注損傷的保護機制尚不明確。有學者推測，蛋白質的O-GlcNAc修飾水平可能通過調節細胞內Ca2+平衡參與調節心肌缺血再灌注損傷[2]。細胞內Ca2+升高可以激活許多Ca2+調節酶，主要包括蛋白激酶、蛋白磷酸酶、磷脂酶、半胱氨酸蛋白酶鈣蛋白和Ca2+/鎮痛依賴性蛋白激酶Ⅱ。其中，鎮痛依賴性蛋白激酶Ⅱ活性的提高不僅與缺血再灌注損傷后心肌的收縮功能障礙有關，還與細胞凋亡及細胞壞死水平有關。

結構蛋白細胞骨骼蛋白α-fodrin的功能喪失在缺血再灌注中起重要作用。與正常灌注相比，缺血再灌注損傷中α-fodrin的145～150 000裂解片段顯著增加。當鎮痛依賴性蛋白激酶Ⅱ上調時，α-fodrin的裂解片段減少，缺血再灌注中的心肌細胞功能損傷明顯緩解。與上調鎮痛依賴性蛋白激酶Ⅱ的結果類似，通過葡萄糖胺或PUGNAc可提高心肌細胞缺血再灌注損傷中的O-GlcNAc水平，也可降低α-fodrin裂解片段的水平，從而減弱再灌注過程中的細胞損傷[15-16]。

同時，葡萄糖胺治療后引起的UDP-GlcNAc和O-GlcNAc顯著增加可以減輕新生兒心肌細胞中血管緊張素Ⅱ誘發的細胞Ca2+過載現象。采用高濃度的細胞外葡萄糖、葡萄糖胺或PUGNAc治療心肌細胞會導致鈣瞬變延遲，而OGT的過度表達會增強這種延遲。因此，在UDP-GlcNAc水平不變的情況下，可使用OGA抑制劑提高O-GlcNAc水平，其與通過葡萄糖胺治療降低由血管緊張素Ⅱ誘發的Ca2+超載對細胞的影響相似[17]。對使用OGT抑制劑細胞的研究發現，葡萄糖胺導致的O-GlcNAc修飾降低，且由血管緊張素Ⅱ導致的Ca2+增加被抑制[18]。由此可見，O-GlcNAc水平上調參與了心肌細胞Ca2+平衡的調節。

另一方面，心肌肌質網鈣離子ATP酶2a(sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2a，SERCA2a)是心肌細胞中鈣處理的中心，通過內質網膜磷蛋白調節心肌細胞Ser16位點的磷酸化，進而調節SERCA2a的功能，而細胞的O-GlcNAc修飾也參與了Ser殘基的修飾，故推測可通過SERC2a的Ser16位點的磷酸化修飾或O-GlcNAc修飾之間的轉換影響SERCA2a的功能，通過葡萄糖胺提高O-GlcNAc水平后，內質網膜磷蛋白與SERCA2a的相互作用明顯增強[19]，故可將蛋白質磷酸化和蛋白質糖基化修飾聯系起來，作為后續蛋白質O-GlcNAc研究的重要關注指標。

3.2O-GlcNAc與線粒體滲透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)形成關系 器官的缺血再灌注損傷導致線粒體的各種功能和結構發生變化，甚至激活線粒體死亡途徑。線粒體對細胞的生存至關重要，在ATP產生和細胞死亡的調節中起重要作用。線粒體死亡途徑最終會形成跨越外層和內層的線粒體膜、允許低分子量(分子量<1 500)分子進入和退出線粒體基質的一個非特異性mPTP。缺血再灌注損傷產生的鈣過載和氧化應激與其他細胞內環境因素的影響共同作用，最終導致內線粒體膜中mPTP的形成。mPTP形成并允許低分子量分子進入線粒體基質，導致滲透壓力不平衡、基質膨脹和外線粒體膜破裂，最終導致細胞死亡[20]。

圍手術期使用的一些靜吸復合麻醉的外源性物質(如腎上腺素、β-阿片激動劑和吸入性揮發性麻醉劑)觸發了全身麻醉狀態下的預處理，這些外源性物質上調了O-GlcNAc的修飾水平，使術中缺血再灌注損傷所致的梗死面積減小，抑制了mPTP的形成[21]。通過mPTP形成過程可知，mPTP的結構包含脫氧核苷酸轉位、環流素D和電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel，VADC)。相關研究表明，VDAC參與mPTP形成過程的關鍵步驟是VDAC的O-GlcNAc修飾[22]，經O-GlcNAc修飾后的VDAC不僅在ATP產生及其消耗中起重要作用，還直接參與了mPTP的形成[23]。因此，可以通過上調O-GlcNAc修飾水平提高VDAC的O-GlcNAc修飾水平，從而抑制氧化應激期間mPTP的形成。

適當使用Thiamet G和葡萄糖胺不僅可抑制mPTP開口的形成，還可改善線粒體功能，長期使用Thiamet G和葡萄糖胺可延長細胞線粒體的平均長度，并提高線粒體內復合體Ⅰ和復合體Ⅳ的活性，增強其生物能量。對經Thiamet G和葡萄糖胺處理的線粒體內的RNA進行測序發現，相關基因的表達提高1.5倍，為利用O-GlcNAc治療代謝疾病提供了新的思路[24]。

3.3O-GlcNAc修飾與活性氧類(reactive oxygen species，ROS)生成 除作為重要信號轉導和調節氧化還原的細胞信號外，ROS還參與了心肌細胞的缺血再灌注損傷。由于O-GlcNAc修飾在調節線粒體功能和全身能量代謝方面起基礎性作用，通過提高蛋白質O-GlcNAc修飾水平可減少缺氧和氧化應激介導的ROS生成，而使用OGA加劇了缺氧引起的ROS生成[25]。O-GlcNAc修飾通過調節抗氧化酶催化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶的表達或活性來衰減ROS生成，由此可見，O-GlcNAc可作為線粒體的關鍵調節器[26]。此外，蛋白質的O-GlcNAc修飾調控叉頭框蛋白轉錄因子，對氧化應激反應酶的催化酶的轉錄進行調控，叉頭框蛋白家族亞群叉頭框轉錄因子O1在O-GlcNAc修飾后被激活，進而激活氧化應激反應酶的轉錄，調節氧化應激相應的下游信號通路及產物，提高細胞氧化應激的耐受性。Thiamet G和葡萄糖胺可影響細胞ROS水平，降低細胞內活性氮、過氧化氫和超氧化物的水平，并通過OGT增強O-GlcNAc修飾或通過OGA減弱O-GlcNAc修飾，以上變化均可顯著改變超氧化物歧化酶或谷胱甘肽過氧化物酶的信使RNA水平，表明蛋白質O-GlcNAc修飾水平的升高抑制了ROS的產生[27-28]。

3.4O-GlcNAc修飾與炎癥因子 缺血再灌注損傷與炎癥密切相關，但炎癥細胞和分子的反應方式仍不明確。O-GlcNAc參與了機體免疫的重要過程。特異性敲除去腸上皮細胞中OGT基因表達的小鼠出現腸道炎癥，小鼠腸上皮細胞O-GlcNAc修飾水平增加，而化學因素誘發的小鼠結腸炎癥降低[29]。此外，O-GlcNAc修飾還參與了調節性T細胞功能的調控，O-GlcNAc修飾水平降低使白細胞介素-2/信號轉導及轉錄激活因子5信號減弱，雖然調節性T細胞的發育正常，但其功能和穩定性下降，導致全身炎癥反應的發生[30]。

重要灌注器官的缺血再灌注損傷導致全身炎癥因子上調，OGT和OGA抑制劑則明顯抑制了缺血再灌注損傷中腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-6的表達，同時炎癥因子與心肌細胞的結合能力降低。在感染、炎癥、創傷、缺血和神經退化時，微膠質細胞與巨噬細胞的激活導致神經元的缺血性死亡，使用Thiamet G后，缺血大腦中的微膠質細胞與巨噬細胞數量減少，且神經細胞中由脂多糖刺激產生的炎癥反應受到抑制[31]。上調的O-GlcNAc修飾水平使激活的微膠質和巨噬細胞減少，并可作為缺血再灌注損傷中抑制否定免疫反應損傷的重要保護機制。

4 小 結

蛋白質O-GlcNAc修飾對缺血再灌注損傷保護機制的研究有助于了解重要器官缺血再灌注損傷的分子機制以及闡明細胞O-GlcNAc修飾在缺血再灌注損傷中的作用，為心肌梗死和腦卒中的臨床管理提供了新的方向。合理使用OGA和OGT對關鍵蛋白進行O-GlcNAc靶向修飾，能夠起到保護細胞的作用。目前的研究重點為明確O-GlcNAc所修飾蛋白的種類和功能并尋找準確高效調控關鍵蛋白質O-GlcNAc修飾水平的方式，以增強重要灌注器官缺血再灌注的耐受力。