非小細胞肺癌免疫微環境的細胞分類及研究進展

謝雯瑩，張大川，王 輝，賈晨昊，李 青

目前肺癌病死率位居惡性腫瘤的首位，其發病率呈逐年增高趨勢[1]。其中非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)是肺癌最常見的病理類型，5年生存率僅為23%[2]。雖然現階段肺癌的手術、放療、化療和靶向治療等治療方案取得了一定的進展，但是多數患者在確診時已發生局部進展或廣泛轉移，預后仍較差。目前，免疫治療已成為包括肺癌在內的實體腫瘤治療的新方案，但僅有30%的患者受益[3]。腫瘤微環境(tumor microenvironment, TME)由腫瘤細胞、免疫細胞、腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)、信號分子和細胞外基質(extracellular matrix, ECM)組成，主要可分為以免疫細胞為主的免疫微環境和以CAFs為主的非免疫微環境。在肺癌TME中，腫瘤細胞可以通過影響腫瘤浸潤免疫細胞以促進腫瘤的發生[4]。本文現就NSCLC免疫微環境的細胞分類及其研究進展進行綜述。

1 T細胞

浸潤在腫瘤局部的淋巴細胞被稱為腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltration lymphocytes, TILs)，浸潤的CD4+和CD8+T細胞及其免疫調節細胞因子在TME中發揮適應性免疫作用。腫瘤間質中CD4+/CD8+T細胞的浸潤與NSCLC患者的預后及生存率密切相關，腫瘤間質淋巴細胞浸潤越多的NSCLC患者，其總生存期(overall survival, OS)和無瘤生存期(disease-free survival, DFS)越長，預后越好[5]。

大量研究表明，腫瘤浸潤CD8+T細胞與肺癌患者的預后顯著相關。Ganesan等[6]的研究結果證實，CD8+T細胞是抑制肺癌生長的關鍵細胞，其生物學效應功能可以被CD4+Foxp3+調節性T細胞(regulatory T cells, Tregs)抑制，基本轉錄譜可用于指導患者選擇更加合適的免疫治療方法，還可用于開發能預測單一或聯合檢查點阻斷治療臨床反應的生物學標志物[7]。細胞程序性死亡受體-1(programmed cell death-1, PD-1)、T細胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T-cellimmunoglobulin mucin-3, TIM-3)、細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen4, CTLA4)、淋巴細胞活化因子-3(lymphocyte activation gene-3, LAG-3)等在CD8+T細胞上的表達與疾病進展有關，且T細胞的活化和效應功能隨著抑制性受體表達的增加而降低[8]。Kim等[9]研究發現肺鱗狀細胞癌中PD-L1和PD-L2的表達與CD8+TILs數量增加和MET基因表達增加有關，這可能為針對PD-1/PD-Ls信號通路靶向治療肺鱗狀細胞癌提供新思路。

除CD8+T細胞外，其他CD4+T細胞，如Tregs和Th17細胞亞群也是導致包括癌癥在內等多種疾病發展的關鍵因素。這兩者在TME中調節細胞因子和趨化因子的產生，促進免疫細胞的募集并參與調節抗腫瘤和促腫瘤免疫細胞的活化狀態，通過改變免疫細胞的數量和功能促進肺癌的發展、轉移[10]。NSCLC患者的CD4+T細胞數量較鄰近正常肺組織的CD4+T細胞數量顯著增多，其中CD4+Foxp3+Tregs在這些腫瘤浸潤細胞中占比較大[6]。Guo等[11]研究發現腫瘤浸潤的Tregs中存在異質性，根據TNFRSF9的表達可以將其分為活性高、低兩群，其中激活態Tregs的比例與肺腺癌患者的不良預后相關。Th17細胞可通過產生IL-17促進炎癥反應，IL-17及其信號通路的改變與肺癌的發生、發展相關，IL-17基因多態性和IL-17信號通路的表觀遺傳改變與肺癌易感性增加有關[12]。目前，關于肺癌中Tregs和Th17細胞亞群的平衡機制及其對評估預后的價值仍需深入探究。

2 B細胞

在NSCLC亞型中，腫瘤浸潤性B細胞(tumor-infiltrating B cell, TIB)總數比癌旁組織多，其中以肺腺癌最為明顯[13]。TIB和CD4+TILs位于三級淋巴結構(tertiary lymphoid structure, TLS)內，TLS與早期NSCLC的良好預后呈正相關，提示TIB在NSCLC中具有抗腫瘤作用。Germain等[14]研究發現，在NSCLC中TLS生發中心發生體細胞高頻突變和類別轉換重組機制被激活，證實B細胞密度對NSCLC患者預后生存具有較高的預測價值，而低密度的CD20+和DC-LAMP+的成熟樹突狀細胞可以用于識別具有高死亡風險的患者，使用這些生物學標志物將有助于調整治療策略。在部分NSCLC患者中，TIB能將內源性腫瘤抗原遞呈給CD4+TILs并改變其表型，對TIB應答的CD4+TILs分別為活化型、抗原相關型和無應答型，在活化型和抗原相關型的CD4+TILs亞群中，活化的TIB與效應T細胞應答相關[13]。目前除抗CD20+B細胞單抗外，B細胞治療還處于臨床前研究階段，未來仍需要開發能有效誘導B細胞放大其他免疫細胞抗腫瘤效應的方法。

此外，TIB也被證實具有促進腫瘤發展的功能。TIB可抑制抗腫瘤免疫反應，而TME促使TIB功能障礙。調節性B細胞(regulatory B cells, Bregs)通過分泌IL-35和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)抑制免疫應答[15]。在自身免疫和自體移植排斥反應中，從TLS中去除B細胞會導致T細胞功能下降，而B細胞(尤其是Bregs)可使群體向Tregs表型傾斜[16]。上述研究顯示，TIB與CD4+TILs在NSCLC TME中的相互作用，有可能成為未來NSCLC免疫治療的潛在靶點。

3 樹突狀細胞(dendritic cell, DC)

DC是髓系來源的抗腫瘤免疫的中樞調節因子，也是功能最強的局部抗原提呈細胞(antigen presenting cell, APC)。免疫檢查點分子B7-H3是NSCLC患者生存較差的獨立預測因子，而在NSCLC患者中，B7-H3在腫瘤組織駐留DC中的表達明顯上調[17]。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells, CIK)聯合樹突狀細胞(DC-CIK)可誘導Lewis肺癌細胞凋亡，其機制可能與14-3-3ζ和p-Bad蛋白的下調有關，證明DC-CIK在NSCLC的聯合治療中有可能成為一種有希望的佐劑[18]。此外，Lee等[19]發現用自體DC介導表達CCL21基因的腺病毒載體(Ad-CCL21-DC)進行瘤內注射可引起全身特異性免疫應答，導致CD8+T細胞浸潤增加以及腫瘤內PD-L1表達增加。Lu等[20]研究發現，NSCLC細胞下調共刺激分子(CD80和CD86)和促炎細胞因子(IL-12和IL-23)的表達，但促進CD1c+DC亞型分泌抗炎細胞因子(IL-10)，從而阻斷體內抗腫瘤免疫。上述研究為未來將免疫治療與原位疫苗接種相結合提供了理論依據，評估PD-1/PD-L1檢查點抑制聯合DC-CCL21的治療作用仍有待研究。

4 髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)

MDSCs是廣泛存在于腫瘤患者的外周血及腫瘤組織骨髓來源的具有強免疫抑制功能的細胞群，其數量和比例與腫瘤大小、惡性程度有關。MDSCs可以通過表達高水平的精氨酸酶、一氧化氮合酶和活性氧抑制T細胞介導的特異性抗腫瘤免疫及NK細胞和巨噬細胞介導的非特異性抗腫瘤免疫[21]。目前，MDSCs可分為粒細胞型(PMN-MDSCs)和單核細胞型(M-MDSCs)。PMN-MDSCs具有許多中性粒細胞的形態和表型特征，但M-MDSCs更接近未成熟的單核細胞。在小鼠和人類腫瘤中，主要為表型與中性粒細胞相似的PMN-MDSCs[22]。臨床資料分析顯示，NSCLC患者外周血M-MDSCs中C-C趨化因子受體5型(C-C chemokine receptor 5, CCR5)的表達明顯高于健康者，且無復發生存率與PMN-MDSCs和CCR5+M-MDSCs在血液循環中的比例呈負相關，與其在腫瘤細胞中的比例無關[23]。Condamine等[24]研究發現中性粒細胞中內質網應激反應可引起血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體(lectin-type oxidized LDL receptor-1, LOX-1)顯著上調，使中性粒細胞轉化為PMN-MDSCs。現有數據顯示,在NSCLC患者中LOX-1+PMN-MDSCs的數量與腫瘤大小相關，但仍需深入研究來評估這些細胞作為NSCLC治療預后生物標志物的潛力。

5 腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages, TAMs)

進入腫瘤組織的巨噬細胞在腫瘤及其微環境來源的抑制性細胞因子的作用下分化成熟為TAMs，在促進腫瘤血管生成和淋巴管生成過程中具有重要意義。TAMs可分化為不同的表型，包括M1型(經典型巨噬細胞)和M2型(替代性活化巨噬細胞)。目前認為TAMs共同表達M1和M2標記，其與M2型巨噬細胞的表型特征和功能特點更為相似[25]。IL-4可以誘導TME中的巨噬細胞M2極化，參與降解ECM并重塑TME[26]。肺癌細胞也能促進TAMs的M2極化，TAMs分泌的TGF-β激活了肺癌細胞的C-Jun和Smad3通路，增加了肺癌細胞SOX9基因的表達，促進了肺癌細胞的上皮-間質轉換，從而促進腫瘤的增殖、遷移和侵襲[27]。Sumitomo等[28]研究發現，肺鱗狀細胞癌間質中的M2 TAMs密度顯著高于肺腺癌，且NSCLC間質中的M2 TAMs密度與淋巴結轉移、病理分期、低DFS和OS變短有關。因此，腫瘤間質M2 TAMs密度是預測腫瘤惡性程度和臨床預后的潛在指標。

6 中性粒細胞

在細胞水平上，中性粒細胞是NSCLC中數量最多的免疫細胞類型，約占免疫細胞總數的20%[29]。有研究發現早期肺癌可以誘導具有APC特征的腫瘤相關中性粒細胞(tumor-associated neutrophils, TANs)亞群形成，這種獨特的細胞亞群能夠交叉呈遞抗原，并增強抗腫瘤T細胞的功能[30]。TANs還可通過合成、分泌相關蛋白酶參與腫瘤的增殖、侵襲及轉移。Mcloed等[31]發現中性粒細胞可通過表達IL-1β介導對NF-κB抑制劑的抵抗從而促進肺癌的發生，這也是NF-κB抑制劑對肺癌治療無效的重要原因之一。

與上述促瘤效應相反，中性粒細胞也有抗腫瘤及抗轉移作用。TANs抑制腫瘤細胞增殖最主要的途徑是通過抗體依賴細胞介導的細胞毒作用減少腫瘤增殖，抗體可以通過TANs表面的Fc受體來識別腫瘤，從而釋放細胞毒介質，產生細胞毒作用，殺傷腫瘤細胞，TANs還可以直接產生細胞毒作用介質，如ROS、髓過氧化物酶等，它們可以殺傷腫瘤細胞，從而抑制腫瘤細胞的增殖[32]。已有研究證實干擾素-β(interferon-β, IFN-β)可抑制腫瘤浸潤中性粒細胞中血管生成因子(如VEGF和MMP-9)的表達，導致缺乏IFN-β的動物體內腫瘤的血管化和生長加快[33]。由于目前在肺癌中多數關于中性粒細胞作用的研究均基于動物實驗，肺癌患者TANs表型和功能的數據有限，對TANs在肺癌中的作用仍需深入探究。

7 自然殺傷(natural killer, NK)細胞

NK細胞是早期抗腫瘤的重要免疫細胞，是抗腫瘤的第一道防線。NK細胞表面表達的免疫抑制性受體和表面活化受體控制著NK細胞的活化以及對靶細胞的殺傷。有研究發現NK細胞的存在并不影響NSCLC患者的臨床療效，可能因為TME能局部重塑瘤內NK細胞的表型，導致激活受體的表達減少，而CTLA4等抑制性受體的表達增加[34]。NK細胞表面可以表達一些免疫抑制分子，如PD-1、LAG-3、TIM-3等[35]。有研究表明肺TME可能誘導抑制NK細胞，且CD8+T細胞浸潤與NK細胞中CTLA4表達呈正相關，提示免疫活性腫瘤中也存在抑制性NK細胞[34]。盡管目前腫瘤免疫治療已取得較大的進展，但仍有相當比例的患者未能從這些治療中獲益，部分原因是缺乏腫瘤特異性NK細胞反應。因此，結合其他療法重新激活NK細胞的方法將可能有利于肺癌患者的治療及預后。

8 TME細胞分類的臨床實踐方法

關于NSCLC中TME細胞分類的臨床應用，目前主要有流式細胞術(flow cytometry, FCM)、免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC)、酶聯免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、Western blot法以及高通量測序(next generation sequencing, NGS)等。FCM可用于檢測NSCLC組織及癌旁組織中Tregs、TILs、MDSCs、TAMs等免疫細胞比率[6,15]，對癌旁組織中的淋巴細胞進行全面的TILs定量[13]。Osinska等[36]使用FCM檢測發現，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中Tregs含量顯著高于外周血，且肺腺癌患者BALF中的Tregs比例高于肺鱗狀細胞癌患者，闡述BALF并分析其在肺癌免疫反應評價中的作用，檢測TME中的Tregs可能對抗癌免疫治療有一定的意義。除FCM外，IHC法檢測腫瘤細胞和浸潤性免疫細胞中PD-L1的表達已成為篩選NSCLC免疫治療優勢人群的相關靶標[19]。ELISA法則可用于分析抗體特異性[14]，陳志等[37]采用ELISA法檢測NSCLC患者及健康人血清中7種自身抗體(p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGAEA1、CAGE)的水平，證實聯合檢測自身抗體陽性率與NSCLC相關，是肺癌篩查和診斷的有效輔助手段。Western blot法可用于獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息，Hou等[18]用該方法證明DC-CIK減少腫瘤細胞中14-3-3ζ和p-Bad蛋白的表達，這可能是DC-CIK誘導Lewis肺癌細胞凋亡的機制之一。Ganesan等[6]采用RNA測序(RNA-Seq)技術對未經治療的早期NSCLC患者腫瘤樣本中的純化CD8+TILs進行分析，證明腫瘤中組織駐留記憶T細胞密度越高，肺癌患者的預后越好，且這種影響與細胞毒性T淋巴細胞密度無關。通過基于FCM、IHC等技術分析并結合全面的基因表達譜，進一步了解免疫治療獲益者的免疫圖譜，將有可能闡明抗腫瘤的免疫機制，從而為免疫檢查點抑制劑的使用提供更加有利的信息。

傳統方法中僅針對腫瘤實質細胞的治療已不能滿足醫學發展的需要，對肺癌TME的研究以及針對微環境藥物的開發開啟了腫瘤治療的新時代。免疫療法有可能成為晚期NSCLC患者新的治療手段，未來需要更深入闡明宿主與腫瘤免疫之間的相互作用和腫瘤免疫逃逸機制，這是腫瘤免疫治療領域的新挑戰。