UPLC-MS法分析紅參中人參皂苷及在2型糖尿病大鼠體內代謝研究

王和宇，黃仁嵩，焦傳新，李 慧，焦麗麗，劉淑瑩，吳 巍

(長春中醫藥大學，吉林省人參科學研究院，吉林 長春 130117)

紅參為五加科植物人參(PanaxginsengC. A. Mey.)栽培品的根和根莖經蒸制后的干燥炮制品[1]，表面半透明、呈紅棕色，是應用最廣泛的一種人參產品，其主要活性成分為人參皂苷[2]。紅參在炮制過程中常伴隨熱解、水解等反應，使化學成分發生變化[3]。近年來，紅參能夠治療、預防2型糖尿病(T2DM)及并發癥的作用受到各國學者的廣泛關注[4-5]。研究表明[6-7]，人參皂苷具有治療T2DM的作用，但直接口服不易吸收，生物利用度較低。Zhou等[8]以紅參中人參皂苷作為藥效物質基礎，對其吸收入血后的作用機制進行了研究[8]。目前，腸道菌群對疾病的影響受到重視[9-10]。康安等[11]指出，藥物分子可與腸道微生物相互作用，產生腸道菌群代謝產物和經腸道菌群轉化的中藥活性成分，與腸道菌群存在互動調控，可能是揭示紅參潛在作用機制的新途徑。因此，有必要鑒定及闡明糞便中存在的人參皂苷。目前，超高效液相色譜-質譜法(UPLC-MS)在分析復雜的中藥成分及其代謝物研究中具有獨特優勢，是揭示中藥藥效物質基礎的有力手段[12-14]。

本研究擬利用UPLC-MS技術定性、定量分析紅參中人參皂苷，對灌胃給予紅參提取物的2型糖尿病大鼠的糞便、血清進行分析測定，并鑒定代謝產物，希望為進一步闡明紅參中人參皂苷的作用機制和藥效物質基礎提供理論依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

Ultimate 3000 超高效液相色譜儀、TSQ Endura 三重四極桿質譜儀(配有電噴霧離子源ESI、Xcalibur數據處理系統)、Thermo Syncronis-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)、ST8R型高速冷凍離心機：均為美國Thermo公司產品；Milli-Q超純水系統：美國Millipore公司產品；BT25S型電子天平：德國Sartorius公司產品；FDU-1100凍干機、N-1300D旋轉蒸發儀：日本東京理化公司產品；HH-4型數顯恒溫水浴鍋：常州智博睿儀器制造有限公司產品；MTN-2800D型氮吹儀：天津Auto-science儀器公司產品；Infinite M200 PRO酶標儀：瑞士TECAN公司產品。

1.2 樣品與試劑

五年生人參：2018年購于吉林撫松，經長春中醫藥大學藥學院王淑敏教授鑒定為五加科植物人參(PanaxginsengC. A. Mey)的干燥根莖；紅參：同批次人參炮制品。以上樣品均儲存于長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院分析篩選實驗室。

Noto-R1(80418-24-2)、Rf(52286-58-5)、Rk1(494753-69-4)、Rh1(80952-71-2)、Rg1(22427-39-0)、Rg2(52286-74-5)、Rg3(14197-60-5)、Re(52286-59-6)、Rc(11020-14-0)、Rd(52705-93-8)、Rb1(41753-43-9)、Rb2(11021-13-9)、Rb3(68406-26-8)、Ro(34367-04-9)人參皂苷對照品：純度>98%，上海寶曼生物科技有限公司產品；乙腈、甲醇：色譜純，美國Fisher公司產品；甲酸：色譜純，美國Tedia公司產品；甲醇、乙醇：北京化工廠產品。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 Thermo Syncronis-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～5 min(19%B),5～25 min(19%～28%B),25～70 min(28%～49%B),70～77 min(49%～90%B),77～80 min(90%B),80～83 min(90%～19%B),83～88 min(19%B)；流速0.2 mL/min；進樣量5 μL；柱溫30 ℃。

1.3.2質譜條件 電噴霧離子源(ESI)，噴霧電壓2.5 kV，負離子掃描模式，質量掃描范圍m/z100.0～1 500.0，霧化氣溫度300 ℃，離子傳輸管溫度350 ℃，鞘氣壓力6.125 MPa，輔助氣壓力1.75 MPa，Xcalibur分析軟件處理數據。

1.4 實驗方法

1.4.1對照品溶液制備 精密稱取1 g人參皂苷Noto-R1、Rf、Rk1、Rh1、Rg1、Rg2、Rg3、Re、Rc、Rd、Rb1、Rb2、Rb3、Ro對照品，加入80%甲醇溶解，分別配制成1 g/L對照品母液。各取適量的對照品母液，使用80%甲醇定容至2 mL容量瓶中，制成混合對照品儲備液，冷藏備用。

1.4.2供試品溶液制備 取紅參樣品，粉碎過篩，精密稱取樣品粉末，置于100 mL球形瓶中，加8倍量蒸餾水，加熱回流提取3次，每次90 min，合并提取液，過濾，用等體積飽和正丁醇水溶液萃取3次，合并正丁醇層，減壓蒸干，得紅參總皂苷。稱量后加入80%甲醇，于5 mL容量瓶中定容，過0.22 μm微孔濾膜，備用。

1.4.3紅參總皂苷測定方法 精密吸取30 μL供試品溶液，置于具塞試管中，氮氣吹干溶劑，加入0.2 mL新配制的5%香草醛冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，密封、搖勻，60 ℃水浴15 min，流水冷卻2 min，加入5.0 mL冰醋酸，搖勻，放置10 min；取30 μL 80%甲醇同法制備空白對照，得空白對照待測樣品。將所得溶液于550 nm處測定吸光度。

1.4.4方法學考察 線性關系考察：取適量的混合對照品儲備液，用80%甲醇逐級稀釋成6個濃度梯度的混合對照品溶液，按1.3節條件進行測定，以質量濃度(x)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標進行線性回歸計算，繪制標準曲線。

精密度實驗：取1.4.1節方法制備的混合對照品溶液，連續進樣6次，每次 5 μL，計算各皂苷單體峰面積的相對標準偏差(RSD)，評價儀器精密度。

重復性實驗：按1.4.2節方法制備6份供試品溶液，每份進樣量5 μL，計算各皂苷單體峰面積的RSD值，評價方法重復性。

穩定性實驗：取1.4.2節方法制備的供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，每次進樣 5 μL，計算各皂苷單體峰面積的RSD值，評價供試品溶液在24 h內的穩定性。

回收率實驗：精密稱取1 mg已知含量的紅參粉末6份，分別置于2 mL容量瓶中，精密加入適量的混合對照品儲備液，進樣測定，計算平均回收率和RSD值。

1.5 生物樣品收集與處理

1.5.1動物實驗 選擇雄性Wistar大鼠，體重(200±20) g，購于吉林大學實驗動物中心。將大鼠置于標準SPF(specific pathogen free) 級無特定病原體屏障環境中，適應環境飼養一周后，采用高脂飼料喂養8周，隨后禁食12 h，腹腔注射新鮮配制的40 mg/kg鏈脲佐菌素檸檬酸緩沖液建立T2DM大鼠模型，一周后測定大鼠空腹血糖值(禁食12 h)，血糖值≥7.8 mmol/L為建立成功的T2DM模型。使用紅參總皂苷以100 mg/kg對10只T2DM大鼠連續灌胃干預21天，干預期間每天收集大鼠新鮮糞便。末次給藥后，大鼠隔夜禁食12 h，麻醉后腹動脈采血，血漿于室溫靜置1 h，于4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，將上清液分裝，置于-80 ℃冰箱，保存。

1.5.2糞便樣品 精密稱取5.0 g于30 ℃烘干、研碎的大鼠新鮮糞便，加入8倍量蒸餾水充分浸泡，100 ℃水浴提取3次，每次1 h。合并提取液，以10 000 r/min離心15 min，上清液中加入等體積正丁醇飽和溶液萃取3次，合并正丁醇層，過濾，減壓蒸干，加入80%甲醇復溶，于5 mL容量瓶中定容，過0.22 μm微孔濾膜，待測。

1.5.3血清樣品 取出保存于-80 ℃冰箱中的血清樣品，置于4 ℃冰箱中復融，渦旋1 min，取100 μL血清，加入500 μL甲醇(4 ℃)，渦旋1 min后，于4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，上清液用氮氣吹干，加入100 μL甲醇復溶，渦旋1 min，于4 ℃以12 000 r/min離心15 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜，待測。

2 結果與討論

2.1 含量測定及方法學考察結果

2.1.1紅參總皂苷 紅參總皂苷回歸方程為y=0.011x+0.04(R2=0.999 2)；精密度實驗RSD為0.87%，表明儀器精密度良好；重復性實驗RSD為1.42%，表明該方法重復性良好；穩定性實驗RSD為1.47%，表明供試品溶液在2.5 h內穩定；平均加樣回收率為98.16%，RSD為1.82%，表明本方法準確、可靠。

紅參總皂苷含量測定：將紅參藥材粉碎，精密稱取5.020 3、5.050 9、5.040 5 g。經計算可知，紅參總皂苷提取率分別為3.24%、3.29%、3.27%。

2.1.2人參皂苷UPLC-MS含量測定 各人參皂苷的回歸方程測定結果列于表1，14種人參皂苷在線性范圍內的線性關系良好。

各人參皂苷的精密度、重復性、穩定性實驗以及加樣品回收率結果列于表2。可知，儀器精密度、方法重現性良好，供試品溶液在24 h內穩定性良好，方法準確、可靠。

表1 人參皂苷線性關系考察Table 1 Linear relationships of ginsenoside

表2 人參皂苷方法學考察Table 2 Methodological of ginsenoside

通過回歸方程計算紅參中人參皂苷的含量，結果列于表3。

表3 人參皂苷含量測定結果Table 3 Determination results of ginsenoside content

2.2 化學成分分析

利用UPLC-MS方法結合MS/MS碎片離子等信息，定性分析14種人參皂苷，示于圖1，人參皂苷MS/MS分析數據列于表4。

2.3 人參皂苷大鼠體內代謝研究

2.3.1糞便中人參皂苷代謝研究 利用UPLC-MS方法結合MS/MS信息，分析了灌胃給藥紅參水提物1～20天的大鼠糞便中的代謝產物。負離子模式下，大鼠糞便樣品處理后鑒定的代謝產物示于圖2。通過保留時間及選擇反應監測模式(SRM)二級質譜信息，檢測到Noto-R1、Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rh1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd、Rg3、Rk114種皂苷。通過分析20天內大鼠糞便代謝產物變化趨勢可知，大鼠經灌胃給藥紅參水提物后，人參皂苷Noto-R1、Rg2、Rg1、Rd在20天內呈遞減的趨勢，其中Noto-R1、Rd在第10～20天內趨于穩定；人參皂苷Re、Rf、Rh1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rg3在前15天內呈遞減趨勢，在第15～20天呈略微升高趨勢；人參皂苷Rk1在20天內趨勢未發生明顯變化。

2.3.2血清中人參皂苷代謝研究 在上述檢測條件下，對灌胃紅參水提物后第21天大鼠血清中的代謝產物進行檢測，在血清中提取到12種人參皂苷，分別為達瑪烷型原人參二醇型皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3，達瑪烷型原人參三醇型皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2，齊墩果烷型皂苷Ro及稀有皂苷Rk1，示于圖3。

注：a.混合對照品；b.紅參水提物圖1 UPLC-MS基峰離子流圖 Fig.1 UPLC-MS base peak chromatograms

表4 UPLC-MS/MS法鑒定紅參提取物Table 4 Identification of red ginseng extract by UPLC-MS/MS

注：*表示P<0.05；**表示P<0.01圖2 灌胃給藥紅參大鼠糞便中人參皂苷變化趨勢Fig.2 Trend of ginsenoside in feces of red ginseng administered by intragastric administration

注：a.Rg1、Rf;b.Re、Rd;c.Rb1;d.Ro;e.Rc、Rb2、Rb3;f.Rg2、Rg3;g.Rk1圖3 灌胃紅參水提物21天大鼠血清中各人參皂苷UPLC-MS圖Fig.3 UPLC-MS chromatograms of ginsenoside in rat serum after oral administration of red ginseng water extract for 21 days

3 結論

本實驗采用UPLC-MS技術對大鼠灌胃人參及炮制品后血漿及糞便中的代謝產物進行研究，通過分析大鼠糞便中人參皂苷含量的變化，表明人參皂苷在腸道菌群的作用下發生了代謝、轉化、脫糖等變化。三醇型人參皂苷與二醇型人參皂苷的區別在于三醇型人參皂苷的C-6位連有羥基，而二醇型人參皂苷的C-6位無羥基取代，二者在腸道中的代謝途徑類似，均是在腸道細菌的作用下，C-3或C-20位的糖鏈發生糖苷鍵開裂[8]，生成次級代謝產物。腸道菌群也可使人參皂苷發生相互轉化，如三醇型人參皂苷Re在腸道中可轉化為Rg1、Rg2、Rh1、F1、PPT，Rg1可轉化為Rh1；二醇型人參皂苷Rb1可轉化為Rd、F2、CK、PPD等。原人參二醇型皂苷口服后吸收較差，大部分在腸道中發生脫糖反應，最終產物為人參皂苷Compound K和原人參二醇PPD。人參皂苷Rb1、Rg3、Rb3、Re和Rg1可通過降低炎癥反應、逆轉胰島素抵抗、降低血糖、降低血脂等途徑改善糖尿病癥狀[15]。本實驗大鼠血清檢測結果表明，有少部分人參皂苷以原型成分吸收入血，如二醇型人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3，三醇型人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2，齊墩果型皂苷Ro和稀有皂苷Rk1等，表明胃腸道并未對人參皂苷進行完全轉化，直接吸收入血的成分可發揮治療T2DM的作用。本研究可為紅參中人參皂苷的檢測及藥效成分探究提供參考。