GP130在膀胱癌中的表達及其與膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲和順鉑敏感性的關系

張欣雨，王智宇，趙文元，馬保錄，陶 濤

(1.青海省交通醫院泌尿外科，青海西寧 810008；2.鄭州大學第一附屬醫院泌尿外科，河南鄭州 450000；3.青海大學附屬醫院泌尿外科，青海西寧 810008)

膀胱癌為泌尿系統高發惡性腫瘤之一，其早期癥狀不明顯，多數患者確診時即為晚期，腫瘤進展快，易發生轉移、復發，預后情況較差[1-2]。隨著醫療技術不斷發展，膀胱癌發病機制逐步清晰，化療仍是不可替代的治療方法[3]。順鉑等化療藥物抵抗和耐藥是影響其應用效果和預后的重要因素之一，復發和耐藥是膀胱癌治療面臨的重要難題[4-5]。糖蛋白-130(glycoprotein-130，GP130)為跨膜蛋白，為多個致癌基因中心點，影響腫瘤的侵襲、轉移、凋亡和增殖等[6]。因此，GP130與膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲等均可能相關。為證實這一假設，本研究檢測GP130在膀胱癌中的表達水平并分析其與膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲和順鉑敏感性的關系，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2018年1月至2020年5月收治的膀胱癌手術治療患者32例為研究對象，納入標準：患者均經病理檢查確診膀胱癌，采用腹腔鏡膀胱癌根治性切除手術治療，檢查完善，臨床資料齊全。排除標準：排除術前經其他抗癌治療患者、復發性膀胱癌患者、合并其他腫瘤疾病患者、合并自身免疫系統疾病患者、合并肝腎功能疾病患者、合并心血管疾病患者等。研究符合倫理學標準且經倫理學委員會同意。32例膀胱癌手術治療患者中男性20例，女性12例；年齡55～76歲，平均(65.68±6.65)歲；膀胱尿路上皮細胞癌29例、鱗狀細胞癌2例、腺細胞癌1例；組織分級為G1分級患者6例、G2分級患者21 例、G3分級患者5例；術后TNM分期為T2N0M0患者29例、T3N0M0患者1例、T3N1M0患者2例。

1.2 主要試劑和儀器膀胱癌T24細胞購自中國科學院上海細胞庫。RPMI1640培養基、胎牛血清均購自美國Gibco公司。Lipofectamine 3000、RNA提取試劑盒、RNase Free 蒸餾水等均購自美國Invitrogen公司。反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司。siRNA-GP130、siRNA-NC、GP130、β-actin引物等均購自上海吉凱基因化學技術有限公司。兔抗人GP130抗體、二抗、ECL試劑盒、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)等均購自上海信帆生物科技有限公司。Transwell小室、蛋白質提取試劑盒購自美國BD公司。GP130、β-actin等BCA試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司。順鉑、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶、四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(microenzyme reaction of tetramethylazazole， MMT)試劑盒均購自美國Sigma-Aldrich公司。采用德國艾本德5331型聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增儀、美國Bio-rad MODEL680型酶標儀、日本Olympus CKX31-A11PHP型倒置顯微鏡等儀器。

1.3 實驗方法

1.3.1免疫組化檢測 免疫組化法檢測膀胱癌組織和癌旁組織的GP130表達水平。膀胱癌組織和癌旁組織標本均常規進行石蠟包埋并切為厚度4 μm的連續切片，進行相應標記后進行免疫組化檢測。二甲苯浸泡20 min脫蠟，以體積分數為100%、95%、85%、75%的乙醇梯度處理，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)洗滌3 min并進行3次重復操作，行微波爐EDTA抗原修復，PBS洗滌3 min并進行3次重復操作，體積分數為3%的過氧化氫室溫孵育10 min以消除內源性過氧化物酶活性，PBS洗滌3 min并進行3次重復操作，山羊非免疫血清封閉10 min，棄去血清，添加一抗，4 ℃冰箱孵育過夜，棄去一抗，PBS洗滌3 min并進行3次重復操作，滴加二抗，室溫孵育10 min，PBS洗滌3 min并進行3次重復操作，滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，室溫孵育10 min，PBS洗滌3 min并進行3次重復操作，行二氨基聯苯胺顯色、蘇木精復染細胞核，體積分數為75%、85%、95%、100%的乙醇梯度各處理3 min，二甲苯透明并進行中性樹脂封片。顯微鏡下隨機選取5個視野(×200)觀察，GP130主要表達于細胞質，以出現淺黃色、棕色或深棕色染色為細胞染色陽性，計算每個視野中100個細胞中陽性染色細胞數比例，陽性細胞染色比例超過5%為表達陽性。

1.3.2脂質體轉染 膀胱癌T24細胞于含體積分數為10%胎牛血清的RPMI1640培養基進行傳代培養，在37 ℃、體積分數為5%CO2恒溫培養箱中，進行傳代培養，每2～3 d/次，并取對數生長期細胞進行實驗研究。根據Lipofectamine 3000說明書，將siRNA-GP130(siRNA-GP130組)、siRNA-NC(siRNA-NC組)轉染細胞，并設立空白對照組(不進行轉染操作)，每組設6個復孔。

1.3.3PCR檢測 PCR檢測各組GP130 mRNA水平。轉染后48 h，取膀胱癌T24細胞進行PCR檢測，根據RNA提取試劑盒進行總RNA提取，經反轉錄試劑盒逆轉錄形成cDNA，進行逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription PCR,RT-PCR)反應，引物序列如下，GP130：正向5′-TACGAATGGCAGCATACACAGA-3′；反向5′-GCTAAGCAAACAGGCACGACT-3′。β肌動蛋白(β-actin)：正向5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′；反向5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。10 μL反應體系如下：SYBR II GREEN 5 μL、正向引物0.4 μL、反向引物0.4 μL、cDNA 2 μL、RNase Free 蒸餾水 2.2 μL。反應程序為95 ℃預變性0.5 min、95 ℃變性1 min、60 ℃退火0.5 min、72 ℃延伸0.5 min，共40個循環后72 ℃延伸10 min，反應產物進行瓊脂凝膠電泳，以β-actin作為內參，通過2-ΔΔCt算法進行GP130 mRNA相對表達量計算。

1.3.4Western blotting檢測 蛋白質印跡法(Western blotting) 檢測各組GP130 蛋白水平。轉染后48 h，取膀胱癌T24細胞常規提取總蛋白質，蛋白上樣60 μg，通過12.5%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離后電轉至聚偏二氟乙烯膜，50 g/L脫脂牛奶封閉1.5 h，添加一抗，4 ℃冰箱孵育過夜，棄去一抗，加入含辣根過氧化物酶的二抗，室溫孵育2 h，ECL試劑盒暗室顯影，Image J 軟件分析處理蛋白灰度值，以目標GP130 蛋白灰度值與β-actin灰度值比值為最終檢測結果。

1.3.5MMT法檢測 MMT檢測各組細胞增殖情況。取對數生長期膀胱癌T24細胞，1×104個/孔接種至96孔板培養24 h，加入20 μL 的5 μg/L MTT試劑，37 ℃、體積分數5% CO2恒溫培養箱中孵育4 h，添加150 μL DMSO震蕩，酶標儀讀取各孔450 nm波長處吸光度(A)，每組均設3個復孔結果取平均值，并設空白對照，空白對照細胞抑制率設定為0，三組細胞抑制率計算公式為“細胞抑制率=[1-(A目標組/A空白對照)]×100%”

1.3.6遷移和侵襲能力檢測 取對數生長期膀胱癌T24細胞，制成2×104/mL細胞懸液，通過劃痕實驗和Transwell侵襲實驗檢測各組細胞的遷移和侵襲能力。遷移測定：Transwell上室接種200 μL細胞懸液，下室接種600 μL含血清培養基，37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中孵育24 h，無菌棉簽除去上層膀胱癌T24細胞并充分清洗，40 g/L多聚甲醛固定0.5 h，結晶紫染色10 min，染色細胞素即遷移細胞素。侵襲測定是以1∶5比例加入RPMI 1640培養液稀釋Matrigel，涂覆于Transwell上室，干燥后根據遷移測定步驟進行后續操作，計算侵襲細胞數。

1.3.7順鉑敏感性檢測 將膀胱癌T24細胞接種于96孔板中，5×103個/孔，通過RPMI 1640培養基培養膀胱癌T24細胞孵育過夜，通過含0.5～1.5 μmol/L(梯度間隔0.1 μmol/L)順鉑的RPMI 1640培養基，培養48 h后添加MTT試劑培養4 h，吸取培養基，加入100 μL DMSO，酶標儀測定570 nm波長各孔A值，繪制細胞活力-順鉑濃度曲線，根據曲線測定比較三組膀胱癌T24細胞的順鉑半數有效濃度(median effective concentration，IC50)。

2 結 果

2.1 膀胱癌組織和癌旁組織GP130表達水平比較

膀胱癌組織GP130陽性表達率為87.50%(28/32)，高于其癌旁組織的46.88%(15/32)，差異有統計學意義(χ2=11.978，P<0.001)。

圖1 膀胱癌組織(A)和癌旁組織(B)GP130表達水平(免疫組化，×200)

2.2 三組GP130表達水平比較siRNA-GP130組GP130 mRNA和蛋白水平均低于siRNA-NC組和空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。siRNA-NC組和空白對照組的GP130 mRNA和蛋白水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1、圖2。

圖2 三組GP130 蛋白表達水平的Western blotting檢測結果

表1 三組GP130表達水平比較

2.3 三組細胞增殖、遷移、侵襲和順鉑敏感性比較siRNA-GP130組侵襲細胞數、遷移細胞數、順鉑IC50均低于siRNA-NC組和空白對照組，而其細胞增殖抑制率則均高于siRNA-NC組和空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。siRNA-NC組和空白對照組的侵襲細胞數、遷移細胞數、順鉑IC50、細胞增殖抑制率比較差異無統計學意義(P>0.05，表2)。

表2 三組細胞增殖、遷移、侵襲和順鉑敏感性比較

3 討 論

膀胱癌為泌尿系統最常見惡性腫瘤之一，化療是其不可替代的治療方法，可在一定程度上延長患者的生存期，改善預后[7-8]。順鉑為膀胱癌一線化療藥物，為細胞毒性化療藥物，順鉑抗癌的主要作用機制為引發DNA損傷和誘導線粒體凋亡，從而促使細胞進入凋亡程序，達到癌癥治療目的[9-10]。化療藥物的重復給藥可能導致腫瘤細胞獲得性藥物抵抗，化療耐受可導致治療失敗是化療治療的一大難題，順鉑抵抗是其治療后復發率高和預后差的一個重要原因，臨床上大約有40%的膀胱癌患者在5年內由于化療抵抗而出現腫瘤的復發，增加了膀胱癌的治療難度，膀胱癌化療的總體預后情況仍較差[11-13]。因此，明確膀胱癌順鉑耐藥機制，確定其發生耐藥的關鍵分子，并通過輔助手段提高膀胱癌對順鉑的敏感性，減輕腫瘤細胞獲得性順鉑藥物抵抗是提高膀胱癌順鉑化療效果的有效方法。腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移涉及到多種細胞生理學改變，亦是影響膀胱癌等癌癥預后的重要因素[14-16]。明確膀胱癌細胞的增殖、侵襲、遷移機制及其關鍵分子亦可指導其有效治療。

GP130廣泛存在于多種組織細胞內，是與腫瘤炎癥免疫微環境、細胞轉移、凋亡、增殖等密切相關的蛋白[17-18]。據研究報道，GP130是白細胞介素(Interleukin，IL)-6、IL-11、IL-27等細胞信號分子的下游配體復合物，這些細胞因子可特異性地結合GP130配體復合物的α鏈，激活下游信號通路從而引發級聯反應[19-20]。因此，GP130可能參與膀胱癌的發生發展。本研究檢測GP130在膀胱癌組織中的表達，結果顯示，膀胱癌組織中GP130陽性表達率高于其癌旁組織，證實了GP130影響膀胱癌的可能性。本研究亦關注GP130與膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲和順鉑敏感性的關系，通過體外實驗研究，采用脂質體轉染法將siRNA-GP130、siRNA-NC轉染至膀胱癌T24細胞，并設立不進行轉染操作的空白對照，PCR 和 Western blotting 檢測結果顯示，siRNA-GP130可有效抑制膀胱癌T24細胞的GP130 mRNA和蛋白表達，MMT法檢測結果顯示，siRNA-GP130抑制GP130 mRNA和蛋白表達后，膀胱癌T24細胞的細胞增殖抑制率出現升高，劃痕實驗和Transwell侵襲實驗檢測結果顯示，siRNA-GP130抑制GP130 mRNA和蛋白表達后，膀胱癌T24細胞的遷移和侵襲能力降低，而通過含順鉑的培養基培養膀胱癌T24細胞測定的順鉑IC50結果顯示，siRNA-GP130抑制GP130 mRNA和蛋白表達后，膀胱癌T24細胞的順鉑IC50降低，證實了GP130參與膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲，且影響順鉑獲得性抵抗情況。因此，在膀胱癌應用含順鉑的一線化療方案時，通過GP130抑制劑的應用可能有助于提高其化療效果并減少順鉑耐藥的發生，減少因順鉑耐藥導致復發的發生，改善療效和預后。

綜上所述，GP130在膀胱癌中的表達上調并參與膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲，且與順鉑敏感性密切相關，GP130抑制可能成為膀胱癌治療的有效方法之一，但仍需進一步實驗研究和臨床試驗證實。