蛛網膜下腔出血后血腫代謝機制及治療研究進展

周新建，趙金兵，余志強，朱云楊，馬駿

蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是指腦底部或表面血管破裂，血液進入蛛網膜下腔，引起一系列臨床癥狀的急性出血性病變，占所有腦卒中的5%～10%。其中，顱內動脈瘤破裂是非創傷性SAH的首要原因(約占85%)[1]。SAH發生后，破入蛛網膜下腔的血腫及降解產物如血紅蛋白、血紅素、鐵離子等具有很強的細胞毒性，其誘發的氧化應激、免疫炎癥、凋亡、壞死及自噬等機制對神經元、內皮細胞等造成致死性損傷[2]。因此，蛛網膜下腔中血腫成分的清除與患者的預后密切相關。現對SAH血腫的成分及損傷、清除機制和相應的臨床治療靶點綜述如下。

1 血腫的組成、代謝及損傷機制

動脈瘤破裂后，血液直接進入蛛網膜下腔形成血腫。紅細胞降解后血紅蛋白(hemoglobin，Hb)隨之釋放，進一步代謝為珠蛋白、血紅素及鐵。血紅蛋白游離出紅細胞時可大量消耗一氧化氮，可導致顱內小血管彌漫性痙攣并繼而引起腦缺血損傷[3]。血紅蛋白經氧化可生成高鐵血紅蛋白并分解出二聚體，隨后降解產生血紅素并釋放鐵離子；血紅素在亞鐵離子(Fe2+)和三價鐵離子(Fe3+)結合狀態下可以介導氧化反應，形成高活性的Fe4+。高鐵血紅素直接與脂質和蛋白質反應形成自由基，其產生的氧化反應及炎癥級聯反應可造成細胞膜、脂質、蛋白質和核酸的結構與功能的破壞[4]。此外，血紅素可直接嵌入細胞膜，釋放鐵離子，對細胞造成致死性損傷。研究發現抑制血紅蛋白或血紅素損傷途徑可顯著增加神經細胞的存活率[5]。鐵離子為血紅蛋白代謝的終末產物，其大量增多導致鐵依賴性脂質過氧化物的快速累積，誘發“鐵死亡”[6]。總之，蛛網膜下腔中血紅蛋白及其各級代謝產物是導致SAH后神經功能障礙的重要因素。

2 蛛網膜下腔出血后血腫代謝機制

SAH后血腫的代謝主要通過以下兩個機制，一是通過內源性機制清除釋放到蛛網膜下腔的紅細胞及其降解產物；另一方面可以通過有創操作加快血腫的清除，減少蛛網膜下腔的血腫負荷。

2.1 內源性血腫代謝機制

2.1.1 紅細胞的內吞 SAH早期，巨噬細胞/小膠質細胞活化為M1型及M2型細胞。M1型細胞大量表達Toll樣受體4(toll like receptor 4,TLR4)，通過激活TLR4-MyD88-NF-κB通路產生大量炎癥因子，其中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎癥因子可以下調CD36在巨噬細胞中的表達。M2型細胞通過分泌CD36、白細胞介素(interleukin，IL)-10等來清除細胞碎片。CD36是巨噬細胞/小膠質細胞表達的一種膜蛋白，也是巨噬細胞和單核細胞上表達的Ⅱ型清除受體。巨噬細胞/小膠質細胞可通過CD36完成對異常紅細胞的吞噬。有證據顯示，在腦出血模型中，血腫及周圍組織中CD36高表達組的血腫清除效率明顯高于CD36低表達組[7]。

核轉錄相關因子2(nuclear transcription related factor 2，Nrf2)-抗氧化反應原件信號通路是機體抗氧化的重要信號轉導通路，選擇性自噬接頭蛋白P62(sequestosome-1)是一種選擇性線粒體自噬受體，可降解泛素化底物蛋白。在機體自噬活動受到抑制時，P62大量聚集，在蛋白激酶的作用下與Keap1結合，釋放Nrf2。SAH動物模型實驗發現Nrf2可以上調CD36介導的噬紅細胞作用[8]；而Nrf2等位基因的缺失降低了P62的表達并抑制紅細胞的降解。因此，P62和Nrf2的相互作用是巨噬細胞發揮吞噬紅細胞作用的一個重要調節機制。此外，PPARγ是一種編碼Nrf2及其他抗氧化蛋白的轉錄激活因子，其通過增加小膠質細胞的吞噬活性和上調CD36來增強血腫代謝。

巨噬細胞表面的酪氨酸激酶AXL和MerTK通過連接蛋白GAS6和蛋白S與蛛網膜下腔的紅細胞結合激活，促進巨噬細胞對異常紅細胞的識別并啟動內吞。在AXL/MerTK缺乏的小鼠SAH模型中，巨噬細胞的激活受限，與對照組相比，其對血腫的清除效率明顯降低，神經功能障礙也較明顯[9]；提示AXL/MerTK介導的巨噬細胞對紅細胞的吞噬作用，在SAH后血腫清除和神經功能恢復具有重要作用。此外，AXL/MerTK的激活可抑制TLR信號通路、上調SOCS1和SOCS3的表達來觸發巨噬細胞的抗炎作用，后者可促使AXL和MerTK蛋白從細胞膜上脫落成為可溶性受體，競爭性地結合GAS6和蛋白S，抑制巨噬細胞的吞噬功能，從而雙相調節紅細胞的內吞作用。

CD47是一種在細胞表面普遍表達的糖蛋白，其相應的配體為SIRPα，主要在巨噬細胞表達。CD47-SIRPα結合后傳遞出抑制信號，抑制巨噬細胞的吞噬活性。在衰老紅細胞和血腫中的紅細胞表面CD47的表達顯著下降，其抵抗巨噬細胞吞噬的功能受到抑制，導致此類紅細胞的清除增加。動物實驗研究發現，對CD47的抑制可有效增加血腫內及血腫周圍巨噬細胞的數量，增加血腫的清除，減輕腦腫脹及神經元的損傷[10]。

然而，SAH后大量紅細胞負荷導致巨噬細胞參與的內吞機制快速飽和，巨噬細胞內的紅細胞繼續降解，其降解產物鐵和血紅素分別通過鐵蛋白及FLVC受體1轉運至細胞外。有研究顯示40%的鐵在巨噬細胞攝取紅細胞后的24 h內被釋放[7]。

2.1.2 血紅蛋白的清除通路 蛛網膜下腔內未被吞噬的紅細胞由于自由基及補體介導的攻擊而發生溶解，血紅蛋白自破裂的紅細胞內釋放并聚集在蛛網膜下腔。CD163是表達于單核細胞/巨噬細胞系的Ⅰ型膜蛋白，可促進巨噬細胞對游離血紅蛋白的識別和吞噬。研究發現，CD163對觸珠蛋白(haptoglobin，Hp)-血紅蛋白復合物的親和力比未結合血紅蛋白高10倍。Hp是由一個或兩個補體控制蛋白(complement control protein，CCP)結構域和一個c端絲氨酸蛋白酶(serine protease，SP)結構域的前蛋白，通過內質網中C1r-樣蛋白在CCP和SP結構域之間剪切生成；其中SP結構域介導血紅蛋白與CD163的結合，CCP區域決定Hp在血液中的集聚狀態。內源性Hp主要由肝臟和網狀內皮系統產生，正常狀態下腦脊液的Hp水平遠低于外周血液水平。在SAH等病理狀態下，Hp可通過血-腦屏障(blood brain barrier，BBB)擴散至腦脊液內。Hp與血紅蛋白結合后可穩定血紅蛋白的活性鐵及促氧化酪氨酸殘基，減少其對腦組織的氧化反應；此外Hp與血紅蛋白結合后其立體結構的改變，暴露出觸珠蛋白β鏈的新表位，使巨噬細胞表面的CD163能夠識別Hp-血紅蛋白(Hp-Hb)復合物并啟動內吞作用，清除游離血紅蛋白[11]。

CD163的細胞外部分可溶性CD163(sCD36)也參與了SAH后Hp-Hb復合物的清除。對SAH患者的腦脊液檢測分析發現，sCD163水平明顯增高，一方面可增強CD163介導的Hp-Hb的清除，另一方面sCD163可與IgG、游離血紅蛋白形成新的復合物，通過Fc-γ受體被巨噬細胞吞噬[12-13]。上述研究表明，Hp-Hb結合途徑及CD163通路是SAH后血紅蛋白清除的重要途徑，在SAH中具有重要的保護作用。

2.1.3 血紅素代謝途徑 未被清除的血紅蛋白進一步降解，其釋放的血紅素對中樞神經系統有損傷作用。血紅素結合蛋白與血紅素具有極高的親和力，研究發現SAH后神經元和神經膠質細胞中血紅素結合蛋白表達上調。表達于巨噬細胞表面的CD91是血紅素結合蛋白-血紅素復合物的內吞受體，是目前已知唯一的血紅素清除蛋白。眾多研究指出，SAH后CD91介導血紅素-血紅素結合蛋白復合物代謝通路是人體清除SAH后血腫代謝產物的重要途經[14]。

人體內存在HO-1及HO-2兩種活性血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO)亞型，其中HO-1主要在膠質細胞、巨噬細胞和內皮細胞中表達，而HO-2在包括神經元在內的大多數細胞中均勻表達。被內吞的血紅素在HO的作用下，分解產生等量的鐵、一氧化碳及膽綠素；膽綠素經膽綠素還原酶的作用進一步轉化為膽紅素。此外，膽綠素通過清除氧化自由基及脂質過氧化物抑制鐵的過量釋放；一氧化碳通過激活cGMP通路結合血紅蛋白，減少血紅蛋白對一氧化氮的消耗[15]。

2.1.4 代謝物鐵的清除 機體內的鐵轉運主要是通過轉鐵蛋白(transferrin，Tf)。Tf主要在肝臟合成，但在中樞神經系統如少突膠質細胞中亦有高表達。鐵-Tf-TfR途徑是正常腦組織鐵轉運的主要通路。在SAH等病理狀態下，腦組織的Tf及TfR表達上調，尤其是TfR在血-腦屏障的內皮細胞中表達上調，是腦內鐵轉運至血循環，降低腦內鐵超載的重要途經。

鐵調素(hepcidin,Hepc)是一種由肝臟合成并分泌的富含半胱氨酸的多肽，通過抑制細胞內鐵的釋放調節機體鐵平衡。動物實驗發現，SAH模型大鼠血清Hepc表達上調，同時腦脊液中以及小膠質細胞、神經元亦有高表達[16]；通過上調Hepc的表達，可抑制血紅素誘導的乳酸脫氫酶釋放，降低了細胞鐵和鐵蛋白的含量，同時抑制轉鐵蛋白受體1的表達，減少巨噬細胞內鐵的釋放，進而降低鐵超載[17]。

2.1.5 腦血管周圍間隙(virchow-robin space，VRS)通路 VRS是腦實質內穿支動脈、毛細血管和引流靜脈周圍的一個潛在腔隙，其內充滿腦脊液，同時含有巨噬細胞和內皮細胞。目前認為，蛛網膜下腔的腦脊液可通過VRS在血管和膠質細胞間進行交換。有研究將少量的可溶性示蹤劑注射到小鼠紋狀體或海馬體灰質后，發現示蹤劑通過細胞外間隙擴散，而增加示蹤劑的劑量后也未在腦實質內發現示蹤劑滯留；這提示腦脊液內的物質可能通過VRS在整個腦血管中擴散。對腦卒中患者的研究發現，顱內微血管的收縮及腦組織彌漫性缺血會導致VRS的擴張及其內腦脊液量的明顯增加，腦脊液通過VRS進入腦組織造成繼發性腦水腫[18]。因此，VRS內的巨噬細胞及內皮細胞可能是一種潛在的血腫清除機制；可能是在SAH早期，血腫成分進入腦脊液并流入VRS，其中的凝血酶激活TNF-α轉移酶，進而切割CD163產生sCD163，與血紅蛋白形成復合物血紅蛋白-sCD163，隨后與IgG結合形成血紅蛋白-sCD163-IgG復合物；后者可誘導鄰近內皮細胞通過旁分泌上調HO-1，也可以自分泌途徑激活FcγR通路誘發巨噬細胞對血紅蛋白復合物的吞噬[19]。然而，VRS相關的血腫清除機制尚不完全清楚，還有待進一步的研究。

3 潛在治療靶點

血腫及其代謝產物介導的毒性作用顯著加重SAH后的繼發性神經損傷，因而，如何減少血腫量及加快血腫代謝產物的清除，從而減輕相關腦損傷是SAH的一個研究重點。

3.1 促進紅細胞的吞噬 研究發現，給予腦出血動物辛伐他汀、羅格列酮等PPARγ激動劑或維甲酸X受體激動劑貝羅沙汀，可上調血腫周邊小膠質細胞表面CD36的表達，繼而增強小膠質細胞對紅細胞的吞噬作用[20-21]。此外，TLR4抑制劑TAK-242通過負調控TLR通路來上調巨噬細胞表面CD36的表達。通過增強CD36介導的血腫清除途徑來促進血腫吸收，同時增加過氧化氫酶表達，降低過氧化氫的含量及其所致的氧化損傷。

另外，動物實驗發現，抑制紅細胞表面CD-47的表達可能促進巨噬細胞對異常紅細胞的識別，增強血腫的代謝。已有臨床試驗證明CD-47抑制劑(TJC4等)可以增強機體對腫瘤細胞的殺傷作用[22]；因此其可作為潛在的加強血腫代謝的藥物，但同時需避免對正常紅細胞的損傷。

3.2 加速血紅蛋白代謝 有研究發現，糖皮質激素可以誘導CD163的高表達，增強其與血紅蛋白-Hp復合物的結合能力；然而，臨床應用糖皮質激素并不能改善SAH患者的神經功能障礙及遠期預后，甚至有增加應激性潰瘍等并發癥發生的風險[23]。SAH動物模型實驗發現，Nrf2激動劑叔丁基對苯二酚可上調CD163表達，增強巨噬細胞的吞噬能力，加速血紅蛋白降解，減少腦血管痙攣、腦積水及血-腦屏障滲漏等并發癥[8]。

此外，外源性補充Hp可能是一個新的治療方向。一項對心血管手術的研究發現，術中給予外源性Hp有助于減少術后因體外循環中產生的游離血紅蛋白所致的急性腎損傷[24]。然而，人群中Hp1和Hp2等位基因的存在，以及Hp常染色體不完全顯性遺傳的特性導致提純的Hp蛋白的免疫原性不同，存在一定免疫排斥反應。目前缺乏對觸珠蛋白表型的快速檢測方法，因此直接補充觸珠蛋白用于SAH的治療尚待進一步的研究。

3.3 增強血紅素的分解 動物實驗研究表明，CD91激動劑TLR7通過激活CD91-巨噬細胞通路，增強對血紅素的代謝，從而對腦組織起到保護作用[25]。此外，在臨床前研究中亦發現，鞘內注射CD91激動劑可促進血紅素的清除[26]。HO是血紅蛋白重要的代謝酶；在一系列SAH動物實驗及小型臨床研究中顯示，TSG-6、miR-183-5p等HO-1激動劑可加強對血紅素的清除，同時抑制NF-κB通路，減輕SAH后的早期炎癥反應，從而對神經組織起到保護作用[27-29]。

3.4 鐵代謝 鐵作為血腫代謝的終末產物，可對神經元等細胞造成明顯損傷。去鐵胺作為一種鐵螯合劑，可與血紅蛋白分解釋放的鐵離子螯合，從而減少鐵的病理性沉積。研究發現去鐵胺可以通過血-腦屏障，延緩血腫內紅細胞的降解和血紅蛋白的釋放；在腦出血動物模型實驗中已證明去鐵胺可以明顯降低血腫及周圍組織中的鐵含量[22]。然而，在甲磺酸去鐵胺治療腦出血的二期臨床試驗中，與安慰劑組相比，治療組患者在發病后90 d時并未表現出明顯的神經功能改善，而在發病后180 d時的療效評估有待進一步的分析驗證[30]。

另外，予以SAH動物模型應用鐵死亡抑制劑(Ferrostatin-1)可以有效降低神經元的死亡，改善SAH的預后[6]。鐵他汀作為另一種鐵死亡特異性抑制劑，在腦出血的動物實驗中也可減少神經元的壞死[31]；其機制可能是減少血紅蛋白相關的鐵沉積，降低了體內脂質活性氧的產生等。

4 結 論

SAH后紅細胞彌散在蛛網膜下腔，其釋放的血紅蛋白、血紅素及鐵等一系列產物對腦組織產生繼發性損傷，嚴重影響SAH患者的預后。機體可通過包括紅細胞吞噬、CD163-Hp-Hb通路、CD91-血紅素-血紅素結合蛋白通路、血紅素-HO機制、鐵代謝等多種內源性途徑清除血腫。然而，機體對血腫自發性清除的能力有限，目前尚無臨床確切有效的藥物可加快內源性血腫的清除。數種針對已有機制的藥物如CD36、CD163或CD91激動劑、CD47抑制劑、TLR4抑制劑、去鐵胺等在動物模型及小樣本臨床試驗的應用取得了良好的效果。綜上所述，SAH后的血腫代謝至關重要，是減輕腦損傷的重要機制，其深層次的代謝機制以及相應的治療靶點仍需進一步研究。