PD-L1、B7-H3 及B7-H4 在宮頸癌免疫治療中的研究進展

蘇雅婷，呂杰，牛雯娟，魏芳

宮頸癌是我國女性最常見的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重影響患者的生活。眾所周知，宮頸癌與人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）持續(xù)感染密切相關，同時腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也與免疫抑制有關[1]，故免疫因素在宮頸癌中的作用不容忽視。免疫檢查點是當前惡性腫瘤治療的研究熱點，其是由腫瘤細胞或抗原提呈細胞表面的配體及免疫細胞表面的受體組成，通過抑制自然殺傷（natural killer，NK）細胞和T 淋巴細胞的活性及功能來促進腫瘤的免疫逃逸，從而促進各種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

在腫瘤免疫中，T 淋巴細胞介導的免疫應答占主導地位，激活T 淋巴細胞需要2 條信號通路：主要組織相容性復合物與T 淋巴細胞抗原受體結合是該細胞活化的第1 條通路；共刺激因子與T 淋巴細胞受體結合是第2 條通路。己知的免疫細胞受體有程序性死亡受體1（programmed death 1，PD-1）、T 細胞免疫球蛋白黏蛋白3（T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing molecule-3，TIM-3）和細胞毒性T 淋巴細胞抗原4（cytotoxic T-lymphocyteassociated antigen 4，CTLA-4），其中PD-1 與程序性死亡配體1（programmed death 1 ligand，PD-L1）是目前研究較多的抑制性免疫檢查點。PD-L1 即B7-H1，與B7-H3 和B7-H4 都屬于常見的負性共刺激因子，是免疫球蛋白B7 家族的成員。隨著PD-L1 在多種惡性腫瘤治療中的成功應用，B7 家族作為共刺激因子逐漸引起關注，迅速成為目前惡性腫瘤治療、自身免疫性疾病和器官移植等方面的研究熱點。在B7家族中，負性調控因子是很重要的組成部分，其通過抑制免疫反應，使腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸。眾多研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1、B7-H3 及B7-H4 在惡性腫瘤中呈高表達且具有一定的臨床意義[2]，其能夠使人體正常的免疫細胞發(fā)生逃逸。現(xiàn)對PD-L1、B7-H3 和B7-H4的生物學特征、在宮頸癌中的表達及其免疫治療中的應用進展進行綜述。

1 PD-L1、B7-H3 及B7-H4 的生物學特征

1.1 PD-L1PD-L1 和PD-1 是當前最熱門、最新的免疫檢查點，PD-L1 作為最早發(fā)現(xiàn)的B7 家族之一，其主要結構包括胞外區(qū)結構域的免疫球蛋白可變區(qū)（IgV）、免疫球蛋白恒定區(qū)（IgC）、跨膜區(qū)及胞內區(qū)[3]，其通過識別PD-1 受體來促進抑制性細胞因子分泌和T 淋巴細胞凋亡，導致癌細胞逃避免疫監(jiān)視和破壞，與多種惡性腫瘤的產生、進展和轉移有不可分割的聯(lián)系。PD-L1 在乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、非小細胞肺癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、結腸癌、腎癌和黑色素瘤等惡性腫瘤中均呈異常高表達，并且與臨床預后不良有關[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，引起PD-L1 表達升高的機制可能有兩方面，一是誘導激活致癌信號轉導通路；二是激活特異性細胞因子，尤其是γ 干擾素（interferongamma，IFN-γ），通過介導腫瘤細胞的炎癥微環(huán)境從而顯著上調PD-L1 表達[5]。耿衛(wèi)樸[6]發(fā)現(xiàn)PD-L1 在乳腺癌組織中表達增加與淋巴結轉移密切相關，陳宏偉等[7]也認為PD-L1 一定程度上反映出甲狀腺癌轉移的風險高低。關于膽囊癌的研究顯示，PD-L1 的高表達現(xiàn)象與膽囊癌生長和侵襲相關，PD-L1 在合并遠處轉移的膽囊癌組織中表達增加，表明PD-L1 參與了膽囊癌的轉移[2]。由此可見PD-L1 表達升高與惡性腫瘤侵襲轉移具有一定的相關性，以PD-L1 為靶點的抑制劑可能更適合于有遠處轉移的惡性腫瘤患者。

當前，PD-L1/PD-1 與腫瘤的研究受到了廣泛關注。有研究認為PD-L1 已成為免疫治療的新靶點，PD-L1 的高表達與胰腺癌患者預后較差有關[3]。在急性髓性白血病（acute myeloid leukemia，AML）免疫逃逸的研究中，PD-L1 會促進AML 進展及免疫逃逸；施加抗PD-L1 抗體可以恢復機體的免疫水平，由此可見抗PD-L1 抗體在抑制AML 發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移的過程中發(fā)揮了關鍵作用[8]。PD-L1 還通過促進上皮-間質轉化、抑制凋亡信號的方式加快細胞惡變過程[9]。由此推測PD-L1 在宮頸癌免疫治療中的應用值得學者們進一步探索。

1.2 B7-H32001 年，Chapoval 團隊鑒定出B7 家族新成員B7-H3（CD276），其位于人類15 號染色體上，是由316 個氨基酸構成的Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外的IgC、IgV、胞質區(qū)和跨膜區(qū)組成[10]。據(jù)報道，B7-H3在許多惡性疾病中異常表達，如子宮內膜癌、卵巢癌、骨肉瘤、乳腺癌、口腔癌、食管癌、結直腸癌及血液系統(tǒng)的惡性腫瘤，與此同時，有研究顯示在膽囊癌、胰腺癌、前列腺癌和黑色素瘤等腫瘤中，B7-H3 的異常表達能增強細胞的侵襲性，促進淋巴結轉移[2,11]，推測B7-H3 會影響癌細胞的生物學特征，并與某些惡性腫瘤的臨床預后不良具有相關性。

B7-H3 的受體暫不明確，且分子生物學功能曾有過爭議。Chapoval 等[12]認為B7-H3 參與IFN-γ 的分泌，促進T 淋巴細胞活化；但后續(xù)大多數(shù)研究證實B7-H3 是通過抑制T 淋巴細胞的活化來發(fā)揮免疫抑制作用。Zhang 等[13]證明腎透明細胞癌表達B7-H3可抑制T 淋巴細胞作用，促進腫瘤的進展。Lee 等[14]將沉默B7-H3 基因的黑色素瘤細胞株接種于小鼠，發(fā)現(xiàn)其腫瘤生長速度明顯變慢，淋巴細胞數(shù)增多，說明B7-H3 表達減少，T 淋巴細胞數(shù)量增多，從而提高抗腫瘤免疫反應。因此，推測B7-H3 是通過抑制T淋巴細胞的活化來發(fā)揮作用的。

1.3 B7-H42014 年，B7 家族另一新成員B7-H4被確定蛋白結構，其胞內區(qū)域有2 個氨基酸分子，胞外區(qū)域有IgC 和IgV 組成的結構域和跨膜區(qū)、信號肽區(qū)、胞質區(qū)[15]。B7-H4 也是跨膜蛋白，在許多惡性腫瘤組織中廣泛表達，如腦腫瘤、腎癌、卵巢癌、子宮內膜癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌及消化道癌，且證實與臨床預后相關[16]。B7-H4 在卵巢癌的診斷中也顯示出巨大潛力[17]。有研究認為B7-H4 的高表達現(xiàn)象和胰腺癌患者預后差相關，同時B7-H4 不僅是臨床預后和惡性腫瘤診斷方面的生物學標志物，也是許多惡性腫瘤的候選治療靶點[3]。

然而B7-H4 的受體也不明確，大量研究表明，B7-H4 可能通過調節(jié)免疫系統(tǒng)，如減少T 淋巴細胞活化、抑制IFN-γ、白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）、IL-6 和IL-10 等細胞因子的產生進行負性免疫調控，從而參與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展；其也可能影響卵巢癌、腎癌、乳腺癌、結直腸癌細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移而直接致癌。而膽囊癌組織中B7-H4 的表達與腫瘤大小呈正相關，表明B7-H4 促進原位膽囊癌生長，且與侵襲轉移有關[2]。此外有學者用單克隆抗體mAb 阻斷B7-H4，發(fā)現(xiàn)小鼠體內結腸癌移植瘤的生長被抑制，從反面證實了B7-H4 的致癌作用[15]。由此可見B7-H4 的表達可能間接或者直接導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

2 PD-L1、B7-H3 及B7-H4 在宮頸癌中的表達及在免疫治療中的應用

2.1 PD-L1 與宮頸癌關于PD-L1 在宮頸癌中的表達，有研究顯示PD-L1 在正常的宮頸組織中幾乎不表達，在宮頸癌細胞和組織中，PD-L1 呈高表達，且腫瘤浸潤超過10 mm 的組織中PD-L1 表達高于腫瘤浸潤低于10 mm 的組織（P＜0.05）[18]，提示PD-L1在宮頸癌患者組織中的高表達與淋巴結侵襲力及腫瘤轉移相關。Tao 等[19]對12 例宮頸癌組織進行免疫組織化學檢查發(fā)現(xiàn)，PD-L1 抑制宮頸癌細胞中T 淋巴細胞的活化，然而，在使用特異性封閉抗體下調PD-L1 的表達后，T 淋巴細胞的抑制作用被抑制。因此推測，PD-L1 是抑制宮頸癌免疫應答的關鍵分子，介導宮頸癌細胞的免疫逃逸。

在宮頸癌治療方面，美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準了5 種抗PD-L1/PD-1 抗體，包括抗PD-1 抗體——帕博麗珠單抗和納武利尤單抗，抗PD-L1 抗體——阿特珠單抗、阿維魯單抗和度伐單抗，它們通過阻斷PD-1 和PD-L1 的結合，盡可能恢復T 淋巴細胞的數(shù)量及正常功能，激活T 淋巴細胞殺傷癌細胞的能力，進而消滅腫瘤細胞及避免腫瘤逃逸，已在多種惡性腫瘤如頭頸部鱗癌、尿路上皮癌、黑色素瘤、肺癌及腎癌等臨床試驗中取得了顯著療效[20-21]。Chung 等[22]對98 例復發(fā)或轉移性宮頸癌患者進行帕博麗珠單抗藥物治療，其中79%的患者表達PD-L1，總體緩解率達14.3%，由此美國FDA 批準帕博麗珠單抗用于化療后病情惡化且高表達PD-L1 的晚期宮頸癌患者[5]，但單藥治療很難達到理想的臨床療效，需結合傳統(tǒng)放化療或其他方法來增加免疫治療的抗腫瘤活性及有效性[23]。

目前，抗PD-L1 抗體用于宮頸癌免疫治療的成果較少，故越來越多的學者研究抗PD-L1 抗體治療宮頸癌的可行性。在Zheng 等[24]的研究中，盡管混合阿特珠單抗的DCCIK 細胞不能完全根除腫瘤，但其在異種移植小鼠中表現(xiàn)出中等強度的抗腫瘤活性，同時提高了存活率。多個臨床中心為進一步了解抗PD-L1 抗體治療宮頸癌的療效和安全性正在進行大量研究，提示PD-L1/PD-1 在宮頸癌的免疫治療中具有廣闊的應用前景。

2.2 B7-H3 與宮頸癌Han 等[10]通過免疫熒光和免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)B7-H3 主要表達在宮頸癌細胞的胞質中，并與宮頸癌細胞的深層間質浸潤相關（P=0.001 3）。B7-H3 在SiHa、CaSki 和H8 細胞中的沉默抑制了細胞增殖，促進細胞凋亡。裸鼠成瘤實驗也進一步證實了B7-H3 的致瘤潛能，敲除B7-H3基因，抑制SiHa 細胞中B7-H3 的表達，最終抑制了裸鼠體內腫瘤的生長。由此推測，B7-H3 參與宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）和宮頸癌的進展。

另有研究顯示，B7-H3 在宮頸癌組織中的高表達與患者的臨床分期以及預后不良呈正相關；進一步采用慢病毒轉染技術來研究B7-H3 對宮頸癌細胞的生物學行為產生的影響，結果顯示下調B7-H3會抑制宮頸癌細胞增殖，而上調則正好相反，其高表達也促進了宮頸癌細胞的遷移和侵襲[11]。這一結果與既往B7-H3 在其他腫瘤中的研究結果類似。例如膽囊癌相關的研究表明，B7-H3 表達增加與膽囊癌生長、侵襲和轉移有關[2]。而在腎癌中，B7-H3 除了抑制腫瘤免疫通路外，還通過促進腫瘤的血管生成來加速腎癌的侵襲轉移[25]。上述研究表明，B7-H3 有助于腫瘤轉移，或將成為宮頸癌及其他惡性腫瘤抗轉移治療的潛在靶標。

Zuo 等[26]研究提示B7-H3 表達下調和功能阻斷均可抑制細胞增殖，并削弱細胞遷移、侵襲能力，同時，抑制B7-H3 還能降低HeLa 細胞的惡性程度，說明B7-H3 還可能是抑制腫瘤惡性程度的關鍵靶點。在動物實驗中，抗PD-L1 和抗B7-H3 雙重阻斷比PD-L1 或B7-H3 單獨阻斷提供更多的CD8+T 淋巴細胞，說明兩者有協(xié)同抗腫瘤作用。B7-H3 還能與PD-1 抑制劑共用卻不增加不良反應，提示抗B7-H3治療可實現(xiàn)雙通路抑制而不增加不良反應，未來可能是更有價值的治療靶點。

2.3 B7-H4 與宮頸癌B7-H4 通過抑制機體T 淋巴細胞免疫反應，減弱機體抗腫瘤免疫，使腫瘤細胞逃避免疫攻擊，促進惡性腫瘤發(fā)生。此外Chen 等[27]發(fā)現(xiàn)喉癌組織中高表達B7-H4 可能與腫瘤復發(fā)密切相關，其通過活化相關信號通路促進了腫瘤細胞的侵襲轉移。那么，B7-H4 與宮頸癌的生長、侵襲轉移及預后情況是否有關呢？

據(jù)報道，B7-H4 于宮頸癌細胞胞膜及胞質中彌漫性表達，在腫瘤間質細胞膜及胞質中也選擇性表達，并隨著宮頸癌組織病理分級增加，其陽性表達率逐步增高[16]。Qiu 等[28]研究也發(fā)現(xiàn)，B7-H4 的表達水平從宮頸炎到宮頸癌逐漸增高（P＜0.001），說明B7-H4 與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關。該研究還認為血清可溶性B7-H4（serum-soluble B7-H4，sB7-H4）水平升高與HPV 感染呈正相關，對CIN 和宮頸癌有一定的診斷價值，血清sB7-H4 可作為評價患者免疫狀態(tài)的標志物。由此，B7-H4 可用于監(jiān)測HPV 相關宮頸癌的進展。B7-H4 在正常的宮頸組織中沒有表達，而在宮頸癌組織中高表達，此現(xiàn)象與淋巴侵襲力及轉移相關[18]。采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測到B7-H4 可能通過靶向血管生成因子、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、MMP-9 和血管內皮生長因子來增強宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力[15]。而B7-H4 高表達也與宮頸癌患者預后不良相關[29]。由此推測，B7-H4 或將成為評估宮頸癌患者臨床預后的潛在標志物。

另有一項B7-H3 和B7-H4 共同影響宮頸癌的研究，選擇在HeLa 和CaSki 細胞中過表達B7-H3和B7-H4，然后與人單核細胞U-937 細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)B7-H3/B7-H4 過表達可誘導U-937 細胞增殖，并可抑制U-937 細胞凋亡[30]。此外，共培養(yǎng)上清液中IL-10 和轉化生長因子β1（transforming growth factor-beta1，TGF-β1）的含量及其蛋白表達水平均升高，裸鼠體內實驗表明，IL-10 和TGF-β1 的表達水平隨B7-H3/B7-H4 表達的增加而顯著增加。而JAK2/STAT3 信號通路的磷酸化是誘導IL-10 和TGF-β1 產生的重要途徑[31]，該通路的激活與癌變有關[32]，故研究者檢測了U-937 細胞的P-JAK2/STAT3通路，發(fā)現(xiàn)其在共培養(yǎng)模型中更為活躍，表明受PJAK2/STAT3 信號通路的調控。因此推測，B7-H3 和B7-H4 可能通過激活P-JAK2/STAT3 通路來促進免疫抑制因子IL-10 及TGF-β1 的表達，從而導致宮頸癌。這為B7-H3 和B7-H4 應用于宮頸癌的免疫治療提供了新的方向，但B7-H3 和B7-H4 的受體及免疫抑制通路尚需進一步探索。

3 結語與展望

宮頸癌的發(fā)生與免疫功能紊亂有關，作為免疫調節(jié)的關鍵分子，負性共刺激因子PD-L1、B7-H3 和B7-H4 與宮頸癌關系密切，他們在宮頸癌中異常表達且具有相應的臨床意義。PD-L1 和PD-1 在宮頸癌免疫治療的臨床試驗中已經取得了一定療效，而B7-H3 和B7-H4 在宮頸癌治療中的應用尚處于早期階段，仍需進一步明確其受體及相關通路。深入鉆研B7-H3 和B7-H4 確切的阻斷機制，有望為宮頸癌甚至其他惡性腫瘤的免疫治療提供新靶點，具有潛在的臨床意義。