循環(huán)腫瘤細(xì)胞在上皮性卵巢癌診治中的進展

秦昭娟，杜逸，鄭艾

卵巢癌死亡率在婦科惡性腫瘤中占第一位。據(jù)2019 年的統(tǒng)計，美國每年新發(fā)卵巢癌患者約22 000例，其中死于卵巢癌的病例數(shù)約14 000 例[1]。卵巢癌發(fā)病隱匿，約70%的患者被發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)進入中晚期。雖然當(dāng)前卵巢癌的診治水平進一步提高，由于手術(shù)縮瘤不滿意、術(shù)后復(fù)發(fā)和化療耐藥等，卵巢癌5 年生存率普遍低于30%。目前血清CA-125 是卵巢癌最敏感的標(biāo)志物，但女性孕期、子宮內(nèi)膜異位等情況均會造成血清CA-125 的升高，CA-125 對卵巢癌診斷假陰性的比例較高[2]。90%來源于卵巢上皮細(xì)胞的卵巢惡性腫瘤為上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）。早在1896 年Ashworth 首先提出循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）的概念，CTC作為一種新型的腫瘤標(biāo)志物，具有獲取樣本容易、創(chuàng)傷小、可重復(fù)的優(yōu)點，且在多種類型的腫瘤如肺癌、乳腺癌等已證實其具有早期診斷、評估抗腫瘤藥物療效及判斷患者預(yù)后的價值[3-4]。CTC 由原發(fā)灶進入血液被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的早期事件[5]，大部分CTC被免疫系統(tǒng)清除，部分幸存的細(xì)胞到達(dá)遠(yuǎn)處器官形成轉(zhuǎn)移灶。目前EOC 的CTC 檢測得到廣泛研究，現(xiàn)主要探討幾種典型的上皮性卵巢癌CTC 捕獲和鑒定的方法，CTC 在EOC 診治中的臨床意義及其臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化的前景。

1 CTC 的表面標(biāo)志物

CTC 的檢測首先需要選擇其表面標(biāo)志物。CTC的形成與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有著密切關(guān)系。在此過程中，腫瘤細(xì)胞的上皮性質(zhì)標(biāo)志物如上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，CK）表達(dá)減少，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如波形蛋白的表達(dá)增加，這種轉(zhuǎn)變有利于減少腫瘤細(xì)胞間的黏附，促進CTC 的產(chǎn)生并向鄰近或遠(yuǎn)處器官組織侵襲轉(zhuǎn)移。血液中的CTC 大致分為上皮型、混合型和間質(zhì)型，若在血液中發(fā)現(xiàn)較多混合型或間質(zhì)型CTC 可能預(yù)示患者轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的風(fēng)險更大[6]。常用的CTC 表面標(biāo)志物包括EpCAM、切除修復(fù)交叉互補蛋白1（excision and repair of cross complementary protein 1，ERCC1）和CK 等。EpCAM 為非鈣離子通道依賴性跨膜糖蛋白，其生物學(xué)功能包括細(xì)胞黏附、增殖、維持未分化狀態(tài)以及調(diào)節(jié)分化等。在EOC 中EpCAM 高表達(dá)，也是最常用的CTC 檢測標(biāo)志物之一。ERCC1 參與核酸切除修復(fù)途徑，介導(dǎo)機體對鉑類化療藥物的抗藥性和敏感性，是卵巢癌鉑類化療藥物可能的耐藥機制之一。Chebouti 等[7]的研究發(fā)現(xiàn)ERCC1 是一個獨立的預(yù)測卵巢癌鉑耐藥性和不良預(yù)后的生物標(biāo)志物。CK 廣泛應(yīng)用于標(biāo)記各種上皮來源的組織和腫瘤細(xì)胞，通過分析CK 亞型有助于確定腫瘤病理類型。人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）是表皮生長因子受體家族酪氨酸激酶受體的成員之一，在腫瘤生物學(xué)過程中起著關(guān)鍵作用[8]，HER2 過表達(dá)與卵巢癌不良預(yù)后相關(guān)。黏蛋白1（Mucins 1，MUC1）是一種高分子質(zhì)量的糖基化的1 型跨膜糖蛋白，在正常卵巢組織中不表達(dá)，在所有組織類型的原發(fā)性卵巢癌中均表達(dá)，在EOC 中表達(dá)率可達(dá)90%。當(dāng)卵巢腫瘤從良性變?yōu)閻盒裕琈UC1 表達(dá)上調(diào)。Aktas 等[9]的研究中卵巢癌患者手術(shù)前和化療后外周血中CTC 表面MUC1 的表達(dá)率分別為50%和47%。MUC16 主要發(fā)揮保護和修復(fù)上皮的作用。MUC16 可以通過與間皮素結(jié)合，抑制腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞，形成免疫突觸，促進卵巢癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[10]。MUC16 與EOC 細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、EOC 的腫瘤形成及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。

CTC 的檢測常受到血液中大量白細(xì)胞和原發(fā)腫瘤異質(zhì)性的影響。EpCAM 雖然是目前檢測EOC 中CTC 最常用的腫瘤標(biāo)志物，但因其在不同CTC 中表達(dá)水平的變化，僅基于EpCAM 進行CTC 檢測，可能丟失一些CTC 亞型[11]，導(dǎo)致檢測的敏感度低。在分析對比了多種研究的基礎(chǔ)上，Zhang 等[12]發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用EpCAM、HER2 和MUC1 進行檢測效果最好。通常來說，聯(lián)合使用兩種及以上的標(biāo)志物將提高CTC 在血液中的富集效率。

2 CTC 的檢測方法

理想的CTC 檢測系統(tǒng)能夠在血液中的強大背景中分離檢測血液所有異質(zhì)性的CTC。Yousefi 等[13]比較了最近十年關(guān)于EOC 的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTC 的檢測率約為12%～43%，發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化后的卵巢癌CTC 具有多樣的生物學(xué)行為。由于CTC 的稀有性以及單個細(xì)胞中存在的核酸以及細(xì)胞間的異質(zhì)性[14]，在運用CTC 檢測技術(shù)診斷腫瘤時面臨巨大挑戰(zhàn)。CTC 檢測包括CTC 的分離與檢測兩個部分。首要是CTC 在血液中的分離，以物理特性為基礎(chǔ)的CTC 分離方法包括密度梯度離心法、上皮腫瘤細(xì)胞體積分離法、膜濾過分離法和細(xì)胞變形性富集法等；基于電子信息技術(shù)的CTC 分離方法主要包括免疫磁珠法、微流控芯片法和光纖陣列掃描法等，主要是利用抗原抗體結(jié)合原理對CTC 進行富集。

2.1 物理分離方法密度梯度離心法是利用CTC在配制的分離液與正常血液細(xì)胞沉降系數(shù)不同，通過離心技術(shù)將不同密度的細(xì)胞區(qū)分在不同區(qū)域，紅細(xì)胞、粒細(xì)胞密度比CTC 大，離心后會沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞密度小于或等于分離介質(zhì)，因此離心后懸浮于介質(zhì)中漂浮于上層，CTC 也留存于單核細(xì)胞富集層。膜濾過分離法是基于CTC 比正常血細(xì)胞的體積大，采用8 μm 孔徑的濾膜將CTC 聚集在濾膜上，但血液中體積較大的正常血細(xì)胞同時也會被富集而造成假陽性。物理分離后CTC 仍保留活力，缺點是缺乏特異性，富集后的細(xì)胞需要進一步檢測排除假陽性，因而限制其運用。

2.2 Cell Search 系統(tǒng)目前大多數(shù)的臨床CTC 研究資料來自于唯一被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的Cell Search 系統(tǒng)，是衡量其他CTC 檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)。原理是利用EpCAM 抗體免疫磁珠富集7.5 mL 外周血中的CTC[15]，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）核染色，CK8、CK18 和CK19 熒光抗體標(biāo)記上皮細(xì)胞，CD45熒光抗體識別白細(xì)胞。符合腫瘤細(xì)胞學(xué)形態(tài)特征并且CK 熒光抗體陽性、DAPI 陽性和CD45 陰性的細(xì)胞被定義為CTC。其截斷值為2 個細(xì)胞。Cell Search系統(tǒng)只能檢測EpCAM 陽性的細(xì)胞。Yoo 等[16]將高密度的透明二氧化硅制作的微珠與EpCAM 抗體結(jié)合，之后CTC 和微珠的復(fù)合體再利用密度梯度離心法與其他細(xì)胞分離，可以分離出低表達(dá)EpCAM 的CTC細(xì)胞。2017 年獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)上市的Cell Collector[17]富集技術(shù)是將包被EpCAM 抗體的Cell Collector 功能區(qū)裝置通過留置針插入患者的靜脈，保持30 min 富集CTC，該技術(shù)是目前效率較高的CTC 富集技術(shù)。

2.3 免疫磁珠法基于細(xì)胞上皮表面抗原與連有免疫磁珠的特異性單抗相結(jié)合，形成抗原-抗體-磁珠復(fù)合物。血液中幾乎所有的細(xì)胞都是反磁性或者弱磁性的，在磁場的作用下，可將特定的腫瘤細(xì)胞進行分離?？贵w的選擇是免疫磁性分離技術(shù)重要環(huán)節(jié)，單用EpCAM 作為檢測標(biāo)志的文獻(xiàn)報道較多，部分報道運用EpCAM 與CK 聯(lián)合檢測，EpCAM 與HER2、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、MUC1 抗體組合對EOC 進行檢測，均獲得較高的分選效率。國內(nèi)有研究采用陰性免疫磁微粒法檢測健康人群與EOC 患者血液中的CTC，結(jié)果顯示EOC 組的CTC 陽性率為90.22%，且隨著腫瘤分期的進展檢測出的CTC 數(shù)目更多，CTC 計數(shù)與EOC 臨床分期具有相關(guān)性[18]。免疫磁性分離技術(shù)的優(yōu)點能夠較好保存細(xì)胞形態(tài)，并可在熒光顯微鏡下觀察。

2.4 微流控芯片基于微流控芯片的分離方法通過在芯片通道內(nèi)部修飾可識別細(xì)胞表面抗原的抗體或核酸適配體，當(dāng)接入待測樣本時，目標(biāo)標(biāo)志物與通道表面捕獲試劑結(jié)合，實現(xiàn)特異性分離。Tsai 等[19]采用以卵巢癌CX-BG1-10-A 適配體包被的磁珠來捕獲血液的CTC，明顯減少混雜的白細(xì)胞數(shù)量，假陽性率比Cell Search 檢測方法低至少兩個數(shù)量級。Tang等[20]將微流系統(tǒng)和免疫磁性分離技術(shù)結(jié)合，其CTC的捕獲效率提高到94%，同時保留捕獲細(xì)胞的形態(tài)，捕獲的CTC 可在顯微鏡下進行原位觀察，與免疫納米磁珠分離后的CTC 還可繼續(xù)培養(yǎng)觀察。Obermayr等[21]結(jié)合密度梯度離心和濃縮、ParsortixTM微流體技術(shù)及實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)富集CTC，消耗CTC 中污染的白細(xì)胞，提高了CTC 富集的純度，從而為臨床研究中CTC 的檢測和分子表征的探索進一步提供了可靠的理論依據(jù)。

2.5 石墨烯材料石墨烯材料是一種由碳原子構(gòu)成的單層片狀結(jié)構(gòu)的二維納米材料，具有良好的生物相容性，可用以固定抗體分子，制成生物傳感器。石墨烯的表面可以被芳香族苯環(huán)非共價修飾，修飾后的石墨烯電傳導(dǎo)性發(fā)生改變，可以放大生物學(xué)效應(yīng)，提高探測的敏感度。以納米結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的氧化石墨烯芯片檢測技術(shù)，使用高傳導(dǎo)性的石墨烯納米片材料富集CTC 的微流體設(shè)備：通過單向磁泳從血細(xì)胞中分離出CTC，然后通過電阻信號的變化從富集細(xì)胞樣本中鑒別CTC[22]。石墨烯納米片可以改變CTC 表面的傳導(dǎo)性，因此可以提高電信號檢測的精確性。Han 等[23]利用納米石墨烯材料研究出了基于兩種不同的電化學(xué)信號——振幅和相位差異的微流體設(shè)備來分離和檢測CTC，通過細(xì)胞大小和石墨烯納米板表面結(jié)合的CTC 的電學(xué)性質(zhì)改變的相位差來鑒定CTC。目前，對于石墨烯材料用于CTC 的檢測方法仍在進一步研究中。

2.6 CTC 鑒定方法將血液中可能的CTC 分離出來后，鑒定CTC 的檢測方法則基于CTC 的生物化學(xué)或者生物物理的特性，以及CTC 與白細(xì)胞表面的抗原特性的差異，通過免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、流式細(xì)胞分析、細(xì)胞化學(xué)染色熒光原位雜交技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)、測序等技術(shù)對其鑒定。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)主要檢測外周血中特異mRNA 的表達(dá)，但只能定性而不能定量[24]。激光掃描細(xì)胞儀作為高通量版的流式細(xì)胞儀，可在較短時間內(nèi)（1 h）自動檢測5×104個細(xì)胞，并能全面分析CTC 內(nèi)部微結(jié)構(gòu)，連續(xù)掃描成像產(chǎn)生可視化數(shù)據(jù)，現(xiàn)已發(fā)展成標(biāo)準(zhǔn)化操作程序分析，是目前CTC 定量檢測的最佳方法。

3 CTC 在EOC 中的臨床應(yīng)用價值

3.1 CTC 與CA-125 早期診斷預(yù)測EOC 的效果Zhang 等[12]應(yīng)用免疫磁珠聯(lián)合多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分別檢測109 例新診斷為EOC 患者血液中CTC 和CA-125 的表達(dá)情況，CA-125＞35 U/mL為陽性，結(jié)果顯示CTC 的陽性率為98%，其中在ⅠA、ⅠB 期患者CTC 和CA-125 的陽性率分別為93%和64%，說明在早期卵巢癌患者檢測CTC 發(fā)現(xiàn)卵巢癌的敏感度較CA-125 更高。2017 年一項前瞻性研究報道了87 例不確定良惡性附件包塊的患者，術(shù)前CTC 的富集和檢測區(qū)分卵巢良性腫瘤與卵巢惡性腫瘤的敏感度為77.4%[25]。在一組118例確診為卵巢癌患者中77 例（65.2%）成功分離出CTC，捕獲到了可能有助于診斷不同組織學(xué)類型卵巢癌亞型增殖潛能的細(xì)胞[26]。上述研究表明，CTC 檢測能在很大程度上提高EOC 早期診斷的敏感度和特異度，血液中檢測到CTC 與卵巢癌的不良臨床結(jié)局、CA-125 和人附睪蛋白4（HE4）升高相關(guān)[27]。

3.2 治療效果的監(jiān)測研究已證實CTC 的檢測可以判斷腫瘤的預(yù)后[28-29]。CTC 的檢測與腫瘤負(fù)荷明顯相關(guān)，且晚期腫瘤的CTC 檢出率高于局限性腫瘤。在129 例未接受治療的患者中，CTC 檢測Ⅰ期和Ⅱ期EOC 惡性腫瘤的敏感度為41.2%，特異度為95.1%，陽性預(yù)測值為77.8%，檢測EOC 所有期次惡性腫瘤的敏感度為83%，陽性預(yù)測值為97.3%，且與腫瘤分期、復(fù)發(fā)和死亡方面有顯著差異，與化療反應(yīng)及生存相關(guān)[30]。另有研究發(fā)現(xiàn)，123 例EOC 患者血液樣本CTC 計數(shù)的變化與治療反應(yīng)高度相關(guān)，隨訪期間CTC（79.5%）的增加比CA-125（67.6%）更敏感預(yù)測進展或復(fù)發(fā)；此外，CTC 的存在與較短的總生存期（overall survival，OS）和無進展生存期（progress free survival，PFS）顯著相關(guān)[31]。Lee 等[32]研究了54 例EOC患者，發(fā)現(xiàn)檢出CTC≥3 個細(xì)胞的患者PFS 下降。最近的一項薈萃分析研究了來自8 項研究的1 184 例卵巢癌患者，結(jié)果表明CTC 陽性的患者OS（HR=2.09，95%CI：1.13～3.88）和PFS（HR=1.72；95%CI：1.32～2.25）降低，預(yù)后較差[33]。Blassl 等[34]研究認(rèn)為CTC可用于預(yù)測EOC 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。因此，對于卵巢癌CTC 的檢測可以用于治療期間的隨訪，判斷療效、預(yù)測疾病復(fù)發(fā)等。

3.3 CTC 用于指導(dǎo)EOC 精準(zhǔn)治療Aktas 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者CTC 表面的分子標(biāo)志物或腫瘤抗原可作為生物靶向治療可能的靶點。程序性死亡配體1（PD-L1）能在卵巢癌、結(jié)直腸癌和惡性黑色素瘤等多種腫瘤中表達(dá)。腫瘤細(xì)胞通過免疫抑制機制來阻止免疫細(xì)胞消滅異常細(xì)胞而生長，免疫細(xì)胞對CTC 的生存能力有影響，PD-L1 的表達(dá)減少導(dǎo)致轉(zhuǎn)移病灶形成減少[35]。Buderath 等[36]與健康對照者相比，在EOC 患者中可溶性PD-L1 的表達(dá)增加，與腫瘤負(fù)荷正相關(guān)；可溶性PD-L2 表達(dá)減少，與鉑耐藥相關(guān)。分離酶（Seprase）是表達(dá)于侵襲性循環(huán)腫瘤細(xì)胞（invasive circulating tumor cell，iCTC）表面的標(biāo)志物，抗分離酶實驗表明iCTC 可促進原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞侵入血液形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[37]。Geethadevi 等[38]研究表明從血液中捕獲酪氨酸激酶受體陽性的CTC 可用于腫瘤細(xì)胞的基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)表征分析，有助于設(shè)計癌癥治療方法，確定癌癥患者對化療藥物效果和耐藥機制。此外，檢測CTC 還可以研究腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的mRNA 和表達(dá)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可能成為抗腫瘤藥物的作用靶點。

4 結(jié)語

提高目前卵巢癌的診治效果需尋求一種高敏感度、特異度的早期腫瘤標(biāo)志物，卵巢癌CTC 的檢測可以為快速和準(zhǔn)確診斷疾病、治療反應(yīng)的實時監(jiān)測過程提供新的思路。CTC 檢測的優(yōu)勢除了研究DNA序列分析外，還能研究腫瘤細(xì)胞表達(dá)的mRNA 和蛋白質(zhì)，而許多蛋白質(zhì)是抗腫瘤藥物的實際靶點，可用于個體化治療。CTC 已在許多類型的癌癥中顯示出預(yù)后價值，并在EOC 中顯示出比CA-125 更好的監(jiān)測工具價值，CTC 可能成為一種越來越有價值的EOC 檢測工具，特別是在早期階段。目前的檢測方法大多是基于腫瘤細(xì)胞表面的抗原抗體反應(yīng)捕獲CTC，如何篩選鑒別不同腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記物仍是一個巨大的挑戰(zhàn)。其次，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一系列有前景的新方法已經(jīng)出現(xiàn)，能夠提高血液中CTC 的檢測和分離水平。目前在早期卵巢癌患者的血液中檢測出CTC 的陽性率普遍較低，且結(jié)果判斷存在爭議，因此仍然需要繼續(xù)研究出更為完善的CTC 分離與檢測系統(tǒng)。盡管血液CTC 作為一種潛在的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物已被廣泛研究，但其固有的稀少性和異質(zhì)性給開發(fā)具有臨床顯著特異度和敏感度的CTC 檢測方法帶來了巨大的挑戰(zhàn)，目前仍然缺乏一個統(tǒng)一客觀的標(biāo)準(zhǔn)建立依賴閾值的標(biāo)準(zhǔn)化CTC 診斷技術(shù)，因此，定量評估CTC 可以發(fā)揮其高預(yù)后價值和檢測耐藥或進展風(fēng)險增加的能力。