超高效液相色譜（UHPLC）對大黃飲片炮制前后化學(xué)成分定性定量分析

趙金秀，賈 勇，安志英，劉 震，楊雲(yún)琢

（廊坊市中醫(yī)醫(yī)院 中藥房，河北 廊坊 065000）

中藥需經(jīng)過炮制后方可入藥，核心原理是通過改變藥物內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ)從而改變藥性。中藥炮制需要遵循辯證了解藥物本身特性，以便調(diào)劑和制劑采用不同的制藥技術(shù)[1]。化學(xué)成分群調(diào)控的藥物生物活性及變化規(guī)律，利用化學(xué)工藝對中藥炮制保留有效成分，對疾病治療具有重要作用。大黃為我國傳統(tǒng)中藥植物，味微苦，寒性，初始記載《本經(jīng)》中具有通利水谷及平胃、下氣的功效。因藥理活性廣泛而適用于內(nèi)外科、兒科、婦科及骨傷科等各科室中，常以不同炮制品入藥[2]。超高效液相色譜（UPLC）是一種全新的檢測技術(shù)，通過利用小顆粒填料等全新的檢測方法而被應(yīng)用于多個領(lǐng)域的技術(shù)研究中，例如醫(yī)學(xué)、藥物、生化等，具有通量高、靈敏度高的特點[3，4]。文獻(xiàn)表明，UPLC 技術(shù)應(yīng)用于中藥領(lǐng)域中對于知曉中藥組成，降低中藥分離困難具有重要幫助[5]。

1 實驗部分

1.1 儀器

ODS（C18）液相色譜儀（中國上海天普分析儀器）；超聲清洗器（中國杭州蕭山余祝超聲波設(shè)備廠）；FA1004C 電子分析天平（中國青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)）；傅立葉變換紅外顯微鏡（FT-IRmicroscope）；UV-1102型紫外-可見分光光度計（上海天美科學(xué)）。

1.2 藥物與試劑

生品藥材大黃購自北京同仁堂。按照《中國人民共和國藥典》相關(guān)的炮制方法，分別制備熟大黃及大黃炭。生大黃購自西安盛興，批號：111001，由中國藥品生物制品鑒定。

1.3 方法

1.3.1 大黃飲片制備

1.3.1.1 熟大黃制備 生大黃與黃酒按照2∶1 比例進(jìn)行均勻攪拌，經(jīng)2h 的悶潤干預(yù)后，置入預(yù)先制作的蒸制處理器中，24h 后，待大黃表面呈現(xiàn)黑褐色,眉部呈現(xiàn)黃色褐色時進(jìn)行自然風(fēng)干處理。

1.3.1.2 大黃炭制備 將生大黃置入220℃的熱鍋中進(jìn)行炒干，待表層呈現(xiàn)黑褐色，內(nèi)部呈現(xiàn)焦褐色時，添加少量清水，火滅后取出。

1.3.2 對照品溶液的制備 分別量取適量的生大黃、熟大黃和大黃炭，電子天平稱量后，放入20mL的量瓶中，加入甲醇超聲溶解液到20mL，所得的溶液為混合對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液 按本實驗提取方法[6]，取生大黃、熟大黃和大黃炭粉末過60 目篩，稱量1g，超聲提取30min 后，冷卻，采用甲醛彌補(bǔ)缺少的劑量，均勻搖晃后，質(zhì)量稱量，繼續(xù)過濾，取得過濾液3mL后，放入20mL 的容器中，甲醇稀釋后再次搖勻，臨近使用時采用0.45μm 濾膜過濾使用。

1.3.4 色譜條件 選擇AgilentZorbaxC18柱（4.6mm 150mm，5m）進(jìn)行實驗，C18柱的流動相、柱溫度、洗脫流速等進(jìn)行觀察，色譜柱條件為溫度28℃，流向甲醇-0.1% H3PO4水溶液，梯度洗脫，見表1。流速0.8mL·min-1，柱溫 25℃，檢測波長 280nm，20μL，時間92min。

表1 樣品甲醇的流動相洗脫梯度Tab.1 Mobile phase elution gradient of sample methanol

1.3.5 方法學(xué)考察 取供試品后，按照色譜條件連續(xù)實驗5 次，計算RSD 值為0.08%表示精密度較好，按照上述色譜條件分別在 0、4、8、16、20、24h 記錄峰值面積，RSD 為0.83%表示穩(wěn)定性較好。取生大黃粉末，按照1.3.3 配制供試品溶液，按照色譜條件觀察峰值面積，RSD 值為1.02%，此方法重復(fù)性較好。

2 結(jié)果及討論

2.1 生大黃、熟大黃及大黃炭炮制前后UHPLC 指紋圖比較

生大黃、熟大黃及大黃炭的UHPLC 指紋圖存在差異，生大黃未經(jīng)炮制蒽醌類含量較多，此外縮合鞣質(zhì)含量增加，經(jīng)炮制后的熟大黃及大黃炭中上述成分較少，但含有較多的沒食子酸和蒽醌苷元物質(zhì)。高效液相色譜發(fā)現(xiàn)在生大黃中蒽醌苷物質(zhì)占比增加，其余炮制成品中蒽醌類占比較少，在檢測的4 種蒽醌類成分中，大黃素8-O-β-D-葡萄糖苷占比較高，在熟大黃及大黃炭中幾乎無表達(dá)。見圖1。

圖1 生大黃、熟大黃及大黃炭UHPLC 指紋圖譜分析（280nm）Fig.1 UHPLC fingerprint analysis of raw rhubarb, cooked rhubarb and rhubarb charcoal（280nm）

2.2 生大黃、熟大黃及大黃炭炮制前后游離蒽醌類成分變化

生大黃、熟大黃及大黃炭中，游離蒽醌類成分大黃酚占比最高的為生大黃，其余炮制成品中蒽醌類占比較少，而在熟大黃炮制中大黃酚表達(dá)較少，大黃素甲醚及蘆薈大黃素增加，見圖2。

圖2 生大黃、熟大黃及大黃炭蒽醌類成分比較Fig.2 Comparison of anthraquinone components in raw rhubarb, ripe rhubarb and rhubarb

在檢測的4 種蒽醌類成分中，大黃素8-O-β-D-葡萄糖苷在生大黃中表達(dá)最高，在熟大黃及大黃炭中幾乎無表達(dá)，大黃素8-O-β-D-葡萄糖苷在生大黃中經(jīng)過炮制后蒽醌苷含量占比降低，說明熟大黃和大黃炭在物理加熱升溫等條件干預(yù)下，蒽醌苷類表達(dá)降低，或一部分蒽醌苷轉(zhuǎn)化為苷元類物質(zhì)，降低瀉下作用，見圖3。

圖3 生大黃、熟大黃及大黃炭蒽醌類成分比較Fig.3 Comparison of anthraquinone components in raw rhubarb, ripe rhubarb and rhubarb

2.3 生大黃、熟大黃及大黃炭炮制前后苯丁酮類成分的變化

生大黃、熟大黃及大黃炭炮制前后苯丁酮類成分存在改變，生大黃中4'-羥基苯基-2-丁酮-4'-O-β-D-（2"－O－沒食子酰基－6"－O－（4'－羥基） 桂皮酰基）增多，熟大黃、大黃炭中降低，大黃炭中4'－羥基苯基－2－丁酮含量增加，剩余苯丁酮類成分含量降低。生大黃、熟大黃及大黃炭炮制前后苯丁酮類成分存在改變，生大黃中4'-羥基苯基-2-丁酮-4'-O-β-D-（2"－O－沒食子酰基－6"－O－（4'－羥基）桂皮酰基增多，熟大黃、大黃炭中降低，大黃炭中4'－羥基苯基－2－丁酮含量增加，剩余苯丁酮類成分含量降低，炮制后苯丁酮苷、二苯乙烯苷在較強(qiáng)的炮制下，生物活性存在破壞，但是有與蒽醌類向苷元轉(zhuǎn)化存在不同，蒽醌類化學(xué)產(chǎn)生苷元，而該類物質(zhì)可分解成沒食子酸，導(dǎo)致炮制后大黃中含量增加，見圖4。

圖4 生大黃、熟大黃及大黃炭炮制前后苯丁酮類成分的變化Fig.4 Change of phenytophenones in raw rhubarb, cooked rhubarb and rhubarb charcoal before and after processing

2.4 生大黃、熟大黃及大黃炭炮制前后二苯乙烯苷類成分的變化

生大黃、熟大黃及大黃炭炮制前后二苯乙烯苷類存在變化，二苯乙烯苷類成分均在熟大黃和大黃炭中含量降低。二苯乙烯苷是大黃中具有活性化合物，經(jīng)炮制后變化規(guī)律與蒽醌苷變化存在差異，大黃中二苯乙烯苷含量占比較高，在熟大黃及大黃炭中能夠具有增加沒食子酸的作用，見圖5。

圖5 生大黃、熟大黃及大黃炭炮制前后二苯乙烯苷類占比分析Fig.5 Analysis of the proportion of stilbene glycosides before and after processing of raw rhubarb, ripe rhubarb and rhubarb charcoal

2.5 生大黃、熟大黃及大黃炭炮制前后鞣質(zhì)類成分占比分析

生大黃中鞣質(zhì)類成分較多，熟大黃及大黃炭中鞣質(zhì)類成分減少，沒食子酸類物質(zhì)增加，蒽醌苷類占比降低，說明，炮制后大黃瀉下藥效降低，而活血化瘀功效增加。鞣質(zhì)類含量降低，與炮制過程遭到破壞而轉(zhuǎn)化成沒食子酸，進(jìn)一步增加大黃炭中沒食子酸含量占比有關(guān)。鞣質(zhì)類生大黃未經(jīng)炮制后并非具有收斂作用，而有顯著的促進(jìn)胃動力功效，而發(fā)揮促進(jìn)胃動力主要物質(zhì)為鞣質(zhì)類炮制后而產(chǎn)生的沒食子酸。而炮制后的熟大黃及大黃炭中沒食子酸降低，這解釋了長時間服用瀉下藥物大黃后導(dǎo)致便秘產(chǎn)生的原因，見圖6。

圖6 生大黃、熟大黃及大黃炭炮制前后鞣質(zhì)類成分Fig.6 Tannin composition of raw rhubarb, cooked rhubarb and rhubarb charcoal before and after processing

3 討論

大黃飲片炮制加工需要遵循中醫(yī)藥理基礎(chǔ)并在了解大黃飲片自身的理化特性的基礎(chǔ)上開展加工處理，按照臨床用藥需求進(jìn)行針對性的調(diào)劑和制劑[6，7]。蒽醌類成分是大黃主要效應(yīng)成分，占比5%左右，以大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚等為主。采用UHPLC 檢測，樣品以甲醇直接超聲提取后檢測蒽醌苷類成分，生大黃、熟大黃及大黃炭中蒽醌苷類成分含量均不斷降低，表示在蒸制等過程中蒽醌類成分遭到破壞，向苷元轉(zhuǎn)化，沒食子酸占比升高[8，9]。UHPLC 指紋圖顯示：與生大黃相比，熟大黃及大黃炭中蒽醌苷類含量變化與大黃苦寒藥效存在一定行，生大黃中蒽醌苷類占比升高，而在熟大黃及大黃炭中降低，而苯丁酮苷、二苯乙烯苷與蒽醌類占比變化存在相似性。揭示了大黃炮制前后質(zhì)量的變化，具有較好的實踐意義[10，11]。本研究具有一定的局限性，實驗方法簡單，后期本課題組會加強(qiáng)和其他相關(guān)研究單位合作，增加樣本量，細(xì)化實驗內(nèi)容，為中藥飲片炮制前后化學(xué)成分分析提供實驗依據(jù)。

4 結(jié)論

結(jié)合傳統(tǒng)及現(xiàn)代大黃藥理苦寒性分為生大黃、熟大黃、大黃炭,通過UHPLC 觀察化學(xué)成分變化，發(fā)現(xiàn)在生大黃、熟大黃、大黃炭順序中縮合鞣質(zhì)、蒽醌苷、苯丁酮苷類含量逐漸降低，沒食子酸、蒽醌苷元類變化與之緊密相關(guān)，說明藥理活性與化學(xué)成分變化存在一定的關(guān)聯(lián)性。