常見礦物基礎油的急性生態毒性評價*

李 錚，王順祥，2，方建華，谷科城，吳兆杰

（1.陸軍勤務學院，重慶 401331；2.中國地質調查局 應用地質研究中心，四川 成都610036）

發光細菌是一種非致病性的兼性好氧生物，革蘭氏染色呈陰性，多分布于海水中，與海洋中發光蜉蝣生物相似，能夠引起海面的發光。目前，國內外已經命名的發光細菌屬[1]主要有：發光異短桿菌屬、發光桿菌屬、希瓦氏菌屬、弧菌屬。我國常用其中3 種發光細菌分別是發光桿菌屬中的明亮發光桿菌、弧菌屬中的青?；【唾M氏弧菌，其中明亮發光桿菌和費氏弧菌都為海洋細菌，而青?；【鸀榈毦?/p>

發光細菌產生的可見熒光實際上是生物本身的一種代謝過程。在正常情況下，活菌體內含有熒光酶、三磷酸腺苷（ATP）以及黃素單核苷酸等發光要素。發光細菌在進行新陳代謝過程中，在有氧以及細胞內熒光酶的催化條件下，能把還原態的黃素單核苷酸（FMNH2）和脂肪醛類物質同時轉化為熒光素（FMN）和脂肪酸類物質，同時釋放出可見藍綠色熒光。其反應過程如下：

發光細菌在進行發光過程中極易受到外界的干擾，特別是當存在毒性物質時，會直接抑制熒光酶的活性或者干擾發光細菌的代謝過程[2]，因此，在一定條件下，利用發光細菌的發光程度可以檢測到物質的毒性強弱。目前，國內已經將發光細菌法測急性毒性試驗廣泛應用于農藥污染和水質污染等各種環境檢測中[3,4]。

本文參照國內外相關文獻以及標準[5-7]，利用發光細菌法對礦物基礎油的急性生態毒性大小作了評價。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

選用我國潤滑油生產過程中常用的12 種礦物基礎油為研究對象，進行急性生態毒性評價。礦物基礎油有以下幾種：I 類礦物基礎油：150SN、400SN、600SN；II 類礦物基礎油：150N、400N、26 號中間基、680 號中間基、KN4006、KN4008、KN4010；III 類礦物基礎油：150N、400N，均由深圳市華美特潤滑科技有限公司提供。

NaCl、ZnSO·47H2O 均為分析純，成都市科龍試劑廠；發光菌凍干粉（Vibrio fischeri，NRRL B-11177，浙江托科司生物技術有限公司）。

微孔板型多功能檢測儀（Glomax Multi，Promega Co）；細胞培養板（96 孔，Corning/Costar Co）；85-2 型數顯恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；BL22-500A 型超聲波清洗器（上海比郎儀器公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 費氏弧菌的復蘇 稱取30g NaCl 倒入燒杯中，溶解后倒入1L 容量瓶中，然后加入超純水定容至1L，得3% NaCl 溶液，儲存備用；稱取20g NaCl倒入燒杯中，溶解后倒入1L 容量瓶中，然后加入超純水定容至1L，得2% NaCl 溶液，儲存在4℃冰箱備用。將保存在-20℃冰箱中的一支費氏弧菌發光細菌凍干粉的安瓿瓶和冷的2% NaCl 溶液取出，放入含有冰塊的燒杯中，用注射器取1.0mL 的2% NaCl 溶液注入發光細菌安瓿瓶中，搖動安瓿瓶，確?；旌暇鶆颍瑥吞K等待10min 至發光穩定，并且發光強度要達到100 萬光子數，此時表明菌液合格，否則重新更換復活菌液。

1.2.2 樣品前處理方法 為了模擬自然生態環境中油品對水域的典型污染狀況，通過制備基礎油的水融合部分WAF 來測定急性毒性，以采用半數效應載荷率（Effect Load 50, 簡稱EL50）作為急性生態毒性的評定參數[8]。其中EL50指的是能引起一半響應生物的某種效應發生變化的溶液中試驗材料的負載率（加入的難溶物質質量與溶液介質體積之比）。該前處理方法獲得的測試數據可作為多組分供試物的整體毒性數據來使用[9]，有學者已經將此法用于魚類和藻類等水生生物的生態毒性試驗[10]。

本文選用費氏弧菌作為受試生物。費氏弧菌是海洋細菌，研究表明，在土壤石油污染及其毒性評價中，費氏弧菌對比明亮發光桿菌和青?；【?，復活能力更好，發光性能更穩定、且污染響應值更寬。由于費氏弧菌屬于海洋發光細菌，因此，本文制備WAF溶液均采用含有3% NaCl 的超純水作為其水溶液。制備WAF 過程中，攪拌的細節等對溶液的影響很大。首先，攪拌的速度需控制好，保證溶液旋渦深度為試液高度的10%~30%，因此，數顯恒溫加熱磁力攪拌器設置攪拌速度在800~1200r·min-1范圍內，此時旋渦深度合適；其次，為了保證油品和NaCl 溶液充分混合并且保證有足夠的接觸時間，需要確定適當的攪拌時間，隨著攪拌時間加長，溶液中油品含量增加，但是增量會漸漸平緩達到飽和。根據Girling,A E 等人對于石油產品水生生物毒性測試的一些建議和實際經驗表明[11]，通常攪拌24h，靜置沉淀1h，就可以實現這一目標。綜合以上因素，本文WAF 制備條件設置為：溫度25℃，攪拌速度設置為900r·min-1，攪拌時間24h，然后靜置沉淀1h。

1.2.3 試驗操作步驟

1.2.3.1 制備WAF 溶液 將1L 3%的NaCl 溶液倒入2.5L 龍頭瓶中，再從溶液頂部緩慢倒入待測油品；然后在容器上蓋上箔紙或非反應的覆蓋物，在攪拌速度為900r·min-1條件下開始攪拌24h，充分混合使待測物質在溶液中盡量溶解或者均勻分散，旋渦深度為試液高度的10%~30%，目的是防止乳化；攪拌完成后靜置1h；靜置結束后，將溶液從容器底部倒出，從底部倒出的前10mL 溶液棄用，取接下來的100mL 溶液即得到一定載荷率的WAF 溶液，毒性測定在取得WAF 溶液后6h 內進行。

1.2.3.2 發光度的測定 本文測試發光細菌發光度采用的是Glomax Multi 型微孔板型多功能檢測儀，該儀器適用于多樣品同時全自動檢測，檢測速度快，節省試劑，檢測功能多。在使用儀器前，先進行儀器預熱：打開儀器電源，預熱大約15min，保持室內溫度25℃。取復蘇后的發光菌液1mL，用2% NaCl 溶液稀釋到40mL，備用。

對潤滑油組分等難溶性混合物，其在溶液中溶解以及分散程度有限，隨著溶液載荷率增大到一定值時，會達到飽和態，不同種類油品載荷率達到飽和態時是不同的，為了使各種油品的WAF 溶液均能達到飽和態，在對基礎油或添加劑進行前處理時，最高載荷率定為10000mg·L-1。首先，進行預實驗，配制1、10、100、1000、10000mg·L-1的樣品 WAF 溶液，每個樣品設置三個平行，同時設置96 孔板第一行設置為陰性質控，第二行為陽性質控。各孔中加入樣品液180μL 和菌液 20μL，總體積為 200μL。放入儀器進行測試，以此為樣品初始發光強度記做S0；記錄陰性質控（2% NaCl） 初始發光強度為C0；陽性質控（10mg·L-1ZnSO4）當做樣品處理。設置 15min 的反應時間，然后，使用微孔板型多功能檢測儀測定受試樣品中發光菌的發光強度，記錄15min 時間，陰性質控初始發光強度為Ct；樣品發光強度記做St；陽性質控當做樣品處理，初始發光強度記做Pt。如果樣品溶液載荷率在達到10000mg·L-1時，發光抑制率小于50%，基本上就不會出現EL50，判斷樣品為無毒；如果樣品溶液載荷率在10000mg·L-1時發光抑制率大于50%，選擇抑制率合適的濃度范圍設計成為6 個濃度梯度，再參照預實驗流程進行測試，用Origin 擬合曲線計算出EL50值。

1.2.3.3 數據處理

（1）校正系數（Cf值） Cf值是指陰性樣品在測試時間段內（15min），菌液相對發光強度的變化，即表明菌液的穩定性，計算方法如下：

（2）有效性實驗結果須滿足以下有效性參數：

①樣品測試15min，Cf值需在0.6~1.8 區間（含0.6 和 1.8）；

②測試時，陰性質控中菌液的最終濃度需不小于106光子數；

③樣品平行測試時，變異系數（標準偏差與平均值之比）CV%≤3%；

④陽性質控測試15min 后，發光抑制率應達到50%左右。

（3）抑制率計算 抑制率又可以稱為光損失率（IR），計算公式如下：

1.2.4 急性生態毒性分級方法 根據Bulich（發光細菌測試儀發明者）的生物發光毒性檢測效應分級標準、中科院南京土壤研究所提出的百分數急性生態毒性分級標準以及一些潤滑油急性毒性評定的相關數據，以半效應載荷EL50值為指標，確定本文中礦物基礎油和潤滑添加劑的急性生態毒性分級方法，見表 1[11]。

表1 急性生態毒性分級方法Tab.1 Acute eco-toxicity grading method

1.2.5 試驗方法的穩定性分析

采用上述方法對I 類 150SN、II 類 400N 以及KN4006 基礎油進行急性毒性評價，考察該方法的穩定性。分別進行3 組平行試驗（編號1,2,3），結果見表2。

表2 發光細菌法測定急性毒性結果Tab.2 Determination results of Luminescent bacteria test

由表2 可知，平行試驗最大偏差在130mg·L-1之內,I 類150SN 和II 類400N 急性毒性結果均為微毒，KN4006 基礎油均為低毒，試驗結果的相對誤差均在2%以內，急性中毒過程是一個很復雜的生化反應，需要采用有效且適合的方法才能夠客觀評價出來，從以上分析結果看出，該試驗方法得出的結果具有良好的穩定性，可用于難溶油品的急性毒性評價。

2 結果與討論

2.1 I 類礦物基礎油的急性生態毒性結果與分析

3 種I 類礦物基礎油在載荷率為10000mg·L-1時，150SN、400SN 和 600SN 的發光抑制率分別為66.5%、78.6%、78.5%，均大于50%，分別配制載荷率為 1000、2000、4000、6000、8000、10000mg·L-1的 WAF溶液進行發光度測試得到發光抑制率大小隨WAF溶液載荷率的變化曲線，見圖1。

圖1 I 類礦物基礎油發光抑制率結果Fig.1 Luminous inhibition rate of type I mineral base oils

由圖1 可知，隨著溶液載荷率的增大，對發光度抑制率在增加，表明毒性就越大。數據經過Origin 處理，得出擬合曲線公式如下：其中Y 為抑制率，%；X為 WAF 載荷率，mg·L-1，相關系數 R2均達到 0.99 以上：

（1）150SN 發光抑制率變化公式：

（2）400SN 發光抑制率變化公式：

（3）600SN 發光抑制率變化公式：

經擬合曲線公式計算得出，3 種礦物基礎油的EL50值分別為 5758.9、4729.7、2903.1mg·L-1。因此，150SN 的急性生態毒性等級為微毒，400SN 和600SN 為低毒。3 種I 類礦物基礎油的急性生態毒性不大，毒性從小到大排序為150SN<400SN<600SN。

2.2 II 類礦物基礎油的急性生態毒性結果與分析

當載荷率為 10000mg·L-1時，II 類 150N、II 類400N、26 號 白 油 、680 號 白 油 、KN4006、KN4008、KN4010 的發光抑制率分別為60.5%、73.4%、42.5%、88%、72.3%、85.2%、91.7%。分別配制載荷率為1000、2000、4000、6000、8000、10000mg·L-1的 WAF 溶液進行發光度測試得到發光抑制率大小隨WAF 溶液載荷率的變化曲線，見圖2。

圖2 II 類礦物基礎油發光抑制率結果Fig.2 Luminous inhibition rate of type II mineral base oils

由圖2 可知，其中26#白油在最高載荷率時抑制率為42.5 %，小于50 %，且隨著載荷率的增加，抑制率基本上趨于一個常數，可以判定其急性生態毒性不會出現EL50值。其它6 種II 類基礎油隨著溶液載荷率的增大，對發光度抑制率在增大。數據經過Origin 處理，得出擬合曲線公式如下，其中Y 為抑制率，%；X 為 WAF 載荷率，mg·L-1，相關系數 R2均達到0.99 以上：

（1）II 類150N 發光抑制率變化公式：

（2）II 類400N 發光抑制率變化公式：

（3）680 號白油發光抑制率變化公式：

（4）KN4006 發光抑制率變化公式：

（5）KN4008 發光抑制率變化公式：

（6）KN4010 發光抑制率變化公式：

經擬合曲線公式計算得出，II 類150N、II 類400N、680 號 白 油 、KN4006、KN4008、KN4010 的EL50值分別為 7081.1、5540.5、2090、4270.3、3387.4、2010.1mg·L-1。根據急性生態毒性分級方法，II 類150N 和II 類400N 毒性等級屬于微毒，680#白油、KN4006、KN4008 和 KN4010 屬于低毒，26#白油屬于無毒?？傮w看來，這7 種II 類礦物基礎油毒性不大，對生態環境急性毒性危害較小。

2.3 III 類礦物基礎油的急性生態毒性結果與分析

當載荷率為 10000mg·L-1時，III 類 150N 和400N 的發光抑制率分別為38.6%、64%。分別配制載荷率為 1000、2000、4000、6000、8000、10000mg·L-1的WAF 溶液進行發光度測試得到發光抑制率大小隨WAF 溶液載荷率的變化曲線，見圖3。

圖3 III 類礦物基礎油發光抑制率結果Fig.3 Luminous inhibition rate of type III mineral base oils

由圖3 可知，其中III 類150N 在最高載荷率時抑制率為38.6%，小于50%，且隨著載荷率的增加，抑制率基本上趨于一個常數，可以判定其急性生態毒性不會出現EL50值。III 類400N 隨著溶液載荷率的增大，對發光度抑制率在增大，數據經過Origin 處理，得出擬合曲線公式如下，其中Y 為抑制率，%；X為 WAF 載荷率，mg·L-1，相關系數 R2達到 0.99 以上：

Ⅲ類400N 發光抑制率變化公式：

經擬合曲線公式計算得出，III 類400N 的EL50值為6459.5mg·L-1。根據急性生態毒性分級方法，III類150N 毒性等級屬于無毒，III 類400N 毒性等級屬于微毒。

3 機理探討

通過對12 種礦物基礎油急性生態毒性分析，結果見表3。

表3 發光細菌法檢測礦物基礎油的急性毒性結果Tab.3 Acute toxicity of mineral base oils detected by luminescent bacteria method

由表3 可知，12 種礦物基礎油急性毒性均較低。其毒性機理可能有以下兩個方面：（1）物理隔離，由于WAF 溶液中可能含有細小油滴，直接與費氏弧菌接觸后隔離氧分子，阻止了代謝過程，造成發光度降低；（2）礦物油自身毒性，有毒物質通過細胞膜交換后進入細胞，對細胞造成破壞或降低熒光酶活性，從而影響發光度。雖然礦物基礎油急性毒性較低，但有研究表明，需要特別注意其生物蓄積性，比如有的礦物油在大鼠身體中積累可形成微小肉芽腫，有的含芳烴類礦物油具有致畸致癌性[12]。

4 結論

參照國內外文獻及標準，利用發光細菌法測定礦物基礎油的急性生態毒性。該方法選用費氏弧菌為受試生物，通過制備水融合部分（WAF）方法對樣品進行前處理，以半數效應載荷率（EL50）作為急性毒性評定參數，這對于油品等難溶性物質的毒性判斷更科學易行。結果表明，該方法相比于魚類、海藻和水蚤等急性毒性試驗，大大縮短了試驗周期，并且具有穩定性良好、簡便、快速、成本低等特點，測試結果可為油品污染的監測以及環境可接受潤滑油的研究提供一些基礎數據。

利用該方法檢測出了12 種常用的礦物基礎油的急性生態毒性大小，并進行了毒性分級。常用的12 種礦物基礎油的急性毒性都較低。試驗結果用Origin 統計繪圖，發現通常情況下礦物基礎油的WAF 溶液載荷率與其發光抑制率呈現出指數遞增關系，可用以下公式表示，其相關系數達到0.99 以上：

式中 Y：抑制率，%；X：WAF 載荷率，mg·L-1；A、t、Y0：常數。