RP-HPLC-UV 法測定經(jīng)典名方金水六君煎中橙皮苷的含量*

宋小雪，陳忠新，閆麗莉，張文娓，田 明

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040）

中華傳統(tǒng)的中醫(yī)藥文化是中華民族的瑰寶，國家食品藥品監(jiān)督管理局聯(lián)合國家衛(wèi)計(jì)委等部門出臺了《中藥經(jīng)典名方復(fù)方制劑簡化注冊審批管理規(guī)定》[1]，篩選并公布了第一批經(jīng)典名方目錄，其中包含100 個古代經(jīng)典方劑，收載于明代張景岳所著《景岳全書》中的金水六君煎也位列其中。該方中共有7味中藥組成，現(xiàn)代臨床上仍廣為傳用，有神效。調(diào)肺補(bǔ)腎，止咳化痰，降逆止嘔為金水六君煎的主要作用，金水六君煎在臨床上主要治療慢性支氣管炎、肺氣腫、哮喘、腎虛咳嗽等呼吸系統(tǒng)方面疾病[2,3]。陳皮主要功效燥濕健脾，祛痰止咳[4]，為方中君藥，本文采用RP-HPLC-UV 法對經(jīng)典名方金水六君煎中陳皮的主要成分橙皮苷進(jìn)行測定，對控制本方劑的安全性及有效性起到至關(guān)重要的作用，也為下一步制劑成型工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定基礎(chǔ)[5]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試藥

Thermo -Sciencetific Ultimate3000 高效液相色譜儀（配有四元泵、在線脫氣裝置、柱溫箱、控溫自動進(jìn)樣器和 UV 檢測器，美國 Thermo 公司）[5]；BT125D電子分析天平（Sartorious）；HH-11-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海助藍(lán)科技有限公司）；KQ-500DB 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

橙皮苷（批號：110721-201014，中國藥品生物制品檢定所）；正丁醇（AR 天津市鼎盛鑫化工有限公司）；HAc（AR 天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；甲醇（色譜純 DikmaPure）；水為純化水，金水六君煎物質(zhì)基準(zhǔn)（自制）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對照品溶液的制備 取橙皮苷對照品5.0mg，精密稱定，加少量甲醇溶解并定容至5mL 容量瓶中，得到濃度為1.0mg·mL-1的橙皮苷對照品溶液，利用0.45μm 微孔濾膜過濾，備用。

1.2.2 色譜條件 色譜柱選用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，以甲醇、HAc 和水為流動相，比例為 35∶4∶61；UV 檢測波長為 283nm，流速設(shè)置為 1.0mL·min-1。進(jìn)樣量為10μL，柱溫設(shè)置為30℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 萃取次數(shù)的考察與結(jié)果分析 精密稱定金水六君煎物質(zhì)基準(zhǔn)1.5g，置錐形瓶中，加水20mL 使之溶解，移至分液漏斗中，加入提前配制好的水飽和正丁醇液萃取5 次，每次量取20mL，分別收集5 次萃取的正丁醇液，蒸干，用甲醇將殘?jiān)謩e溶解，并定容至10mL 容量瓶中，即得。

表1 為供試品萃取次數(shù)結(jié)果。

表1 供試品萃取次數(shù)結(jié)果Tab.1 Result table of extraction number of samples

由表1 可知，5 次萃取所測得的含量加和為6.5343mg·g-1，前3 次萃取所測得含量加和占總量的97.82%，說明萃取3 次時(shí)橙皮苷含量可達(dá)97%以上，故將此供試品的萃取次數(shù)定為3 次。

2.1.2 供試品溶液制備方法的確定 根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，確定本品供試液制備方法如下：取金水六君煎物質(zhì)基準(zhǔn)1.5g，精密稱定，置錐形瓶中，加水20mL使之溶解，移至分液漏斗中，加入提前配制好的水飽和正丁醇液萃取3 次，每次20mL，將3 次萃取所得上層正丁醇液合并，于水浴蒸干，所得殘?jiān)由倭考状既芙猓⑥D(zhuǎn)移定容至10mL 容量瓶中，即得。

2.2 專屬性試驗(yàn)（空白試驗(yàn)）

2.2.1 供試品溶液的制備 制備方法同“2.1.2”項(xiàng)下供試品制備方法。

2.2.2 對照品溶液的制備 同“1.2.1”項(xiàng)下對照品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液制備 按照金水六君煎物質(zhì)基準(zhǔn)制備方法，制備出不含陳皮藥材的供試品，照“2.1.2”項(xiàng)下供試品處理方法制備出陳皮陰性對照溶液。

2.2.4 試驗(yàn)方法與結(jié)果分析 照“1.2.2”項(xiàng)下色譜條件，將上述制備的供試品溶液、對照品溶液及陰性對照溶液于0.45μm 微孔濾膜過濾后裝入液相進(jìn)樣小瓶中，放置于高效液相色譜儀中，設(shè)置程序自動進(jìn)樣各10μL，測定峰面積，記錄色譜圖。HPLC 色譜圖見圖1。

圖1 色譜圖Fig.1 Chromatograms of map

由圖1 可知，橙皮苷出峰時(shí)間為8.86min 左右，且供試品峰分離度良好，在橙皮苷峰相近的保留時(shí)間內(nèi)，陰性樣品無色譜峰被檢出，因此，可以說明陰性樣品對橙皮苷的測定無影響，試驗(yàn)方法有效。

2.3 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性范圍

取1.2.1 項(xiàng)下對照品溶液，放置于高效液相色譜儀中，設(shè)置進(jìn)樣體積分別為 2、4、6、8、10、12、14μL，測定記錄峰面積，即得。結(jié)果見表2。

表2 橙皮苷線性回歸數(shù)據(jù)Tab.2 Hesperidin linear regression data

以橙皮苷對照品含量及其峰面積為橫縱坐標(biāo)，利用賽默飛高效液相色譜儀自動得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為∶Y=20.474X－0.6305，R2=0.9994，結(jié)果表明，橙皮苷在進(jìn)樣量為2~14μg 之間時(shí)線性關(guān)系良好，見圖2。

圖2 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Hesperidin standard curve

2.4 精密度試驗(yàn)與結(jié)果分析

取金水六君煎物質(zhì)基準(zhǔn)1.5g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，0.45μm 有機(jī)微孔濾膜過濾至液相小瓶中，每次進(jìn)樣10μL，連續(xù)進(jìn)樣6 針，計(jì)算橙皮苷含量與RSD 值。結(jié)果見表3，HPLC色譜圖見圖3。

表3 橙皮苷精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Test results of hesperidin precision

圖3 橙皮苷精密度考察色譜圖Fig.3 Chromatographic chart of hesperidin precision investigation

由表3、圖3 可知，在此色譜條件下，測定的橙皮苷峰分離度良好，且連續(xù)6 次進(jìn)樣的RSD 值小于3%，表明該高效液相色譜儀精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)與結(jié)果分析

取金水六君煎物質(zhì)基準(zhǔn)1.5g，精密稱定，共6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，0.45μm 微孔濾膜過濾至液相小瓶中，設(shè)置進(jìn)樣體積為10μL，分別計(jì)算橙皮苷含量與RSD 值。結(jié)果見表4，HPLC色譜圖見圖4。

表4 橙皮苷重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Repeatability test results of hesperidin

圖4 橙皮苷重復(fù)性考察色譜圖Fig.4 Chromatogram of hesperidin repeatability

由表4、圖4 可知，在相同色譜條件下測定的6批供試品中橙皮苷峰分離度良好，且RSD 值小于3%，表明該方法有較好的重復(fù)性。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)及結(jié)果分析

取金水六君煎物質(zhì)基準(zhǔn)1.5g，精密稱定，按“2.3.2”項(xiàng)下確定的方法制備供試品溶液，0.45μm 微孔濾膜過濾至液相小瓶中，放置于高效液相色譜儀中，設(shè)置程序每隔1h 進(jìn)樣10μL，連續(xù)進(jìn)樣 12h，計(jì)算橙皮苷含量與RSD 值。結(jié)果見表5，HPLC 色譜圖見圖5。

圖5 橙皮苷穩(wěn)定性考察色譜圖Fig.5 Chromatographic chart of hesperidin stability

表5 橙皮苷穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Test results of stability of hesperidin

由表5、圖5 可知，測定的12h 內(nèi)供試品中橙皮苷含量穩(wěn)定，其RSD 值小于3%，說明該供試品處理方法所得溶液在12h 內(nèi)測定橙皮苷含量均穩(wěn)定。

2.7 加樣回收試驗(yàn)與結(jié)果分析

取金水六君煎物質(zhì)基準(zhǔn)0.75g，精密稱定，共6份，精密加入4.4mg·mL-1的橙皮苷對照品溶液1mL至每份樣品中，按“2.3.2”項(xiàng)下確定的方法制備供試品溶液，0.45μm 微孔濾膜過濾至液相小瓶中，設(shè)置進(jìn)樣體積為10μL，計(jì)算回收率，結(jié)果見表6，HPLC色譜圖見圖6。

表6 橙皮苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Test results of hesperidin recovery by adding samples

圖6 橙皮苷加樣回收色譜圖Fig.6 Chromatographic chart of hesperidin recovery by sampling

由表6、圖6 可知，6 批供試品中的橙皮苷加樣回收率在95%~105%之間，且RSD 值均小于3%，說明該處理方法測定橙皮苷含量準(zhǔn)確。

2.8 含量測定

分別取不同批次金水六君煎物質(zhì)基準(zhǔn)1.5g，共15 份，精密稱定，按“2.3.2”項(xiàng)下確定的方法制備供試品溶液，0.45μm 微孔濾膜過濾至液相小瓶中，放置于高效液相色譜儀中，每批進(jìn)樣10μL，計(jì)算含量，結(jié)果見表7，HPLC 色譜圖見圖7。

表7 金水六君煎物質(zhì)基準(zhǔn)含量測定Tab.7 Determination of reference substances in Jinshui Liujun Decoction

由表7、圖7 可知，綜合上述結(jié)果，考慮到不同批次及產(chǎn)地間含量有所差異，最終確定金水六君煎物質(zhì)基準(zhǔn)中每克含橙皮苷含量不得少于5.0mg。

圖7 15 批金水六君煎物質(zhì)基準(zhǔn)的橙皮苷含量考察色譜圖Fig.7 Determination of hesperidin in 15 batches of Jinshui Liujun Decoction

3 結(jié)論

本文建立RP-HPLC-UV 的方法對經(jīng)典名方金水六君煎中橙皮苷的含量進(jìn)行測定，通過方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果證明，該方法準(zhǔn)確穩(wěn)定，操作便捷，為經(jīng)典名方金水六君煎的下一步成型工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定基礎(chǔ)，有利于促進(jìn)中醫(yī)藥文化繁榮進(jìn)步。但陳皮中含有復(fù)雜的物質(zhì)，本文的研究只針對陳皮中單一成分進(jìn)行測定，對其他成分的研究有待進(jìn)一步開發(fā)，探索中醫(yī)藥之路深遠(yuǎn)而復(fù)雜，需要我們認(rèn)真研究，為弘揚(yáng)中醫(yī)藥文化獻(xiàn)力。