遼東山區(qū)產(chǎn)辣蓼中3 種黃酮類成分含量比較研究*

孫 智，張建逵，李佳穎，于 淼，楊燕云

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

中藥辣蓼為蓼科一年生草本植物水蓼（Polygonum hydropiper L.）的全草。具有行滯化濕，散瘀止血，祛風(fēng)止癢，解毒之功效。用于濕滯內(nèi)阻，血滯經(jīng)閉，風(fēng)濕痹痛，濕疹，風(fēng)疹，毒蛇咬傷等[1]。辣蓼常作為制作中藥神曲的原料使用，也可直接配伍使用，臨床多用于治療囊腫[2]，具有抗炎[3]、抗病毒[4]、抗氧化[5]和驅(qū)殺蟲(chóng)[6]作用。辣蓼在我國(guó)廣泛分布，并在湖南、廣西、貴州等南方省份得到廣泛應(yīng)用，并在遼寧，其藥用情況僅見(jiàn)于《遼寧中藥志》[7]。在《遼寧省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[8]中，收載了辣蓼藥材的標(biāo)準(zhǔn)。但在其鑒別項(xiàng)下，只記載了顯微鑒定和槲皮素的薄層色譜鑒定方法。沒(méi)有含量測(cè)定的要求。在第四次全國(guó)中藥資源普查工作中發(fā)現(xiàn)，遼東山區(qū)辣蓼資源豐富，但并沒(méi)有得到充分的開(kāi)發(fā)和利用。其質(zhì)量如何，至今也鮮有報(bào)道。現(xiàn)代研究表明，辣蓼的有效成分為黃酮類化合物[9]，槲皮素、槲皮苷、金絲桃苷等為辣蓼含量較高的重要成分[10-12]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法，對(duì)遼東山區(qū)不同產(chǎn)地的辣蓼中金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素3 種黃酮類成分含量進(jìn)行測(cè)定和比較，為辣蓼藥材的質(zhì)量研究及資源開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑及試藥

1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；包括G7115A 型VWD 檢測(cè)器，G7129A 型四元泵；TD 型電子天平（余姚市金諾天平儀器有限公司）；JD60-4 型電子天平（沈陽(yáng)龍騰電子有限公司）；CP225D 型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；KQ5200DB 型數(shù)控超聲清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；FW100 型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

乙腈、甲醇均為色譜純，默克公司；甲醇、H3PO4均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)：Y01D7X25998 上海源葉生物科技有限公司）；槲皮苷對(duì)照品（批號(hào)：P01M8F30364 上海源葉生物科技有限公司）；槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：C20J6Y1722 上海源葉生物科技有限公司）。

2018~2020 年，每年8 月均從遼東山區(qū)不同產(chǎn)地采集辣蓼藥材，共11 批。均經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張建逵副教授鑒定為蓼科植物水蓼（Polygonum hydropiper L.）的全草；具體來(lái)源見(jiàn)表1。所有樣品均粉碎后，過(guò)40 目篩備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

Waters symmetry-C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，以甲醇（A）-乙腈（B）-0.3% H3PO4水溶液（C）為流動(dòng)相。洗脫程序見(jiàn)表2。檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm，流速為 1.0mL·min-1，柱溫為 30℃，進(jìn)樣量 10μL。在此條件下供試品中金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素均能達(dá)到很好的分離。結(jié)果見(jiàn)圖1。

表2 梯度洗脫表Tab.2 Gradient elution table

圖1 HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取金絲桃苷對(duì)照品、槲皮苷對(duì)照品、槲皮素對(duì)照品適量，精密稱定，加純甲醇制成每 1mL 含 25.0μg 金絲桃苷、19.0μg 槲皮苷、67.0μg 槲皮素的混合溶液，即得。

1.2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末約2.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入純甲醇25mL，密塞，稱定重量，超聲50min，超聲溫度50℃，放冷，再稱定重量，用純甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系考察

精密稱定0.40mg 金絲桃苷對(duì)照品, 1.80mg 槲皮苷對(duì)照品，0.20mg 槲皮素對(duì)照品，置于10mL 容量瓶中，用甲醇定容，即為對(duì)照品溶液，待用。分別精密吸取 3、5、10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。精密吸取1mL 對(duì)照品溶液，置于10mL 容量瓶中，用甲醇定容，進(jìn)行測(cè)定。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：金絲桃苷Y=27.3953X+3.6637，r=0.9998；槲皮苷 Y=24.6683X-8.7419，r=0.9998；槲皮素 Y=27.6316X+3.3116，r=0.9999。結(jié)果表明，金絲桃苷含量在 4.1～41.0μg·mL-1，槲皮苷含量在 7.0～176.0μg·mL-1，槲皮素含量在2.4～27.0μg·mL-1范圍內(nèi)具良好的線性關(guān)系。

2.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取S9樣品粉末2.0g，按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，精密吸取供試品溶液10μL，平行進(jìn)樣5 次。結(jié)果辣蓼中金絲桃苷、槲皮苷和槲皮素RSD 分別為1.42%、1.84%、2.33%，表明此方法重現(xiàn)性良好。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密稱取S9樣品粉末2.0g，按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，分別于 0、2、4、6h 進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得金絲桃苷的RSD 值為2.50%，槲皮苷RSD 值為2.65%，槲皮素RSD 值為2.48%，表明供試品溶液在6h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取S9樣品粉末5 份，每份1.0g，分別按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，測(cè)定峰面積，測(cè)得金絲桃苷RSD 值為1.79%，槲皮苷RSD 值為2.90%，槲皮素RSD 值為2.85%。表明此方法重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知成分含量的S9樣品粉末6 份，每份1.0g（金絲桃苷平均含量為0. 2830mg·g-1，槲皮苷平均含量為 0.3261mg·g-1，槲皮素平均含量為0.1547mg·g-1），按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，并精密加入濃度為10.8μg·mL-1的金絲桃苷，9.3μg·mL-1的槲皮苷，8.7μg·mL-1的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液30mL，在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Result of recovery tests

由表3 結(jié)果可見(jiàn)，測(cè)得平均回收率和RSD 值分別為：金絲桃苷99.9%、2.5%；槲皮苷102.2%、2.2%；槲皮素101.7%、2.0%。表明回收率良好。

2.6 樣品含量測(cè)定與數(shù)據(jù)分析

將11 批樣品按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算金絲桃苷、槲皮苷和槲皮素的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.4 Result of sample content determination

由表4 可知，測(cè)得遼東山區(qū)不同產(chǎn)地（S1~S1）1辣蓼藥材中金絲桃苷含量在0.0576～0.4706mg·g-1之間；槲皮苷含量在0.2742～1.9319mg·g-1之間；槲皮素含量在 0.0341～0.1655mg·g-1之間。其中，S11金絲桃苷含量最高，與最低相差8.17 倍；S1槲皮苷含量高，與最低相差7.05 倍；S4槲皮素含量最高，與最低相差4.85 倍。結(jié)果表明，遼東山區(qū)辣蓼藥材質(zhì)量不均一，金絲桃苷含量差異最為顯著，其中S10辣蓼中金絲桃苷、槲皮苷含量最少。

為了與其他地區(qū)的辣蓼藥材3 種黃酮類成分含量進(jìn)行比較，將文獻(xiàn)[12-17]中廣東省、廣西省、海南省、貴州省等南方省區(qū)的數(shù)據(jù)與本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，遼東山區(qū)的11 批樣品均與南方省區(qū)的樣品相交錯(cuò)，不能單獨(dú)聚為一類，因此，需要進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析。將文獻(xiàn)[12-17]中南方省區(qū)的數(shù)據(jù)并為一類，各成分含量數(shù)據(jù)分別與本實(shí)驗(yàn)測(cè)得數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果表明，各地區(qū)金絲桃苷含量均呈正態(tài)分布（P＞0.05），各地區(qū)槲皮苷與槲皮素含量均不呈正態(tài)分布（P＜0.05）。因此，對(duì)于各地區(qū)金絲桃苷含量數(shù)據(jù)采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，對(duì)各地區(qū)槲皮苷與槲皮素含量數(shù)據(jù)采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，結(jié)果為：遼東山區(qū)與其他地區(qū)辣蓼藥材在金絲桃苷與槲皮苷的含量上無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但在槲皮素含量上，遼東山區(qū)產(chǎn)辣蓼藥材極顯著低于南方省份產(chǎn)辣蓼（P＜0.01）。遼東山區(qū)產(chǎn)辣蓼藥材中3 種黃酮類成分平均含量均低于南方省份產(chǎn)辣蓼。因此，可以認(rèn)為遼東山區(qū)辣蓼藥材質(zhì)量與文獻(xiàn)[11-16]中產(chǎn)自廣東省、廣西省、海南省、貴州省等南方省區(qū)的辣蓼質(zhì)量有所不同。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)的采樣范圍，從最南端的莊河市到最北端的西豐縣，涵蓋了遼東山區(qū)的大部分區(qū)域，采樣具有一定的代表性。文獻(xiàn)[11-16]的采樣地點(diǎn)包括廣東、廣西、海南、貴州、云南等省的多個(gè)地區(qū)，范圍較廣。所以二者的比較具有一定意義。部分文獻(xiàn)[10-12，16]報(bào)道了各地辣蓼藥材中蘆丁的含量，本實(shí)驗(yàn)也曾對(duì)蘆丁含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有樣品中蘆丁含量極低或未檢出，因此，未將該成分的檢測(cè)結(jié)果列出。所以從總體而言，遼東山區(qū)產(chǎn)辣蓼藥材槲皮素和蘆丁成分含量較南方各省產(chǎn)辣蓼低。且李明等對(duì)16 個(gè)產(chǎn)地辣蓼藥材的質(zhì)量研究結(jié)果表明，南方產(chǎn)辣蓼中蘆丁和槲皮素兩種成分含量均比北方產(chǎn)辣蓼高[16]。本研究結(jié)果與此基本一致。這可能與各地環(huán)境差異及種質(zhì)不同有關(guān)，可認(rèn)為是一種與南方省區(qū)所產(chǎn)辣蓼不同的化學(xué)生態(tài)型。有文獻(xiàn)報(bào)道了位于遼西的錦州市、遼南的大連市產(chǎn)辣蓼藥材中蘆丁和槲皮素含量也與遼東山區(qū)產(chǎn)辣蓼不同[16]，這也可能與遼東山區(qū)產(chǎn)辣蓼不是一種化學(xué)生態(tài)型有關(guān)，有待于進(jìn)一步深入研究。

在第四次全國(guó)中藥資源普查工作中發(fā)現(xiàn)，遼東山區(qū)辣蓼資源豐富，但缺乏充分的開(kāi)發(fā)和利用。本研究建立了辣蓼中3 種黃酮類成分的含量測(cè)定方法，并通過(guò)對(duì)遼東山區(qū)產(chǎn)辣蓼中上述成分的比較，為辣蓼藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及資源的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。