XAGE1A與PD-L1在非小細胞肺癌中的表達特點及相關性研究

孫晨 汪碩敏 夏云紅

肺癌是全球發病率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)為死亡率最高的病理分型，是威脅人們身心健康的重要腫瘤類公共健康問題[1]。隨著醫療水平的提高，以程序性死亡受體/配體1 (programmed death 1/ligand 1, PD-1/L1)[2-4]等為靶點的綜合治療方式一定程度上提高了NSCLC患者的生存質量和時間，但多數患者預后仍然較差[5]。X抗原家族成員1A(X antigen family member 1a, XAGE1A)是癌癥/睪丸(Cancer/testis, CT)抗原家族的成員[6-8]，其介導的免疫保護作用有利于免疫療法的實施[9-10]。伴隨免疫治療的快速發展，作用于PD-1/PD-L1的免疫檢查點抑制劑成為晚期NSCLC的有效治療方法[11-12]，但國內外關于XAGE1A與PD-L1在NSCLC患者中的表達特征及相關性研究尚未有報道，因此探討XAGE1A與PD-L1的關系，尋找NSCLC診療的潛在分子標志物具有重要意義。

資料與方法

一、樣本來源

選擇安徽醫科大學第四附屬醫院腫瘤科2017年01月至2020年01月的NSCLC患者75例，納入標準：①納入研究的患者經病理切片診斷均證實為NSCLC；②患者為初診病例，術前均未接受放化療、靶向治療或免疫治療等其它治療；③患者一般資料完整，且入組前均已簽署知情同意書；④患者在手術治療后均可配合門診或電話隨訪。根據患者入院早晚隨訪時間為5～36月不等，中位隨訪時間為24個月?；颊吲R床資料如下：患者年齡57.31±6.45歲；女性35例(46.67%)，男性40例(53.33%)；脈管侵犯56例(74.67%)，無脈管侵犯19例(25.33%)；低分化21例(28%)，中高分化54例(72%)；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期52例(69.33%)，Ⅲ～Ⅳ期23例(30.67%)；伴有淋巴結轉移者15例(20%)；腫瘤直徑以5 cm為界，大于5 cm共40例(53.33%)，小于5 cm 共35例(46.67%)；有遠處轉移者8例(10.37%)，無遠處轉移者67例(89.33%)；選取75例NSCLC患者病理標本中，取距腫瘤組織≥5 cm的非腫瘤組織作為癌旁組織，癌旁組織經病理組織學檢查均未發現癌細胞。

二、主要試劑

DAB顯色試劑盒(36303ES01)和免疫組化試劑盒(36312ES75)均購自上海翊圣生物科技有限公司，兔抗人XAGE1A多克隆抗體(PRO-1256)購自艾美捷科技公司，PCR逆轉錄試劑盒(RR047A)和熒光定量PCR試劑盒(RR820A)均購自大連TAKARA公司，RNA裂解液(TRIzol)購自美國Invitrogen公司等。

三、RT-qPCR

取50～100 mg組織樣本加RNA裂解液1 mL，搖勻消化3～5 min后加入氯仿約200 μL在4℃ 12000 g離心15 min。上清液混入0.5 mL異丙醇， 4℃ 12000 g離心10 min，無酶水溶解后測RNA濃度。根據Takara試劑盒進行反應體系的配置，去除基因組DNA反應為42℃、2 min，反轉錄反應為37℃、15 min轉85℃、5 s。反轉錄樣本行qPCR反應體系配置，按預變性95℃、30 s，擴增40個循環，條件設置為95℃、5 s轉 60℃、30 s。XAGE1A forward primer, 5′-CCCAGGAGCCCAGTAATGGAGAG-3′; XAGE1A reverse primer, 5′-TCTGTCTGCTGCCC AGGTGTAG-3′; PD-L1 forward primer, 5′-GCTGCAC TAATTGTCTATTGGG-3′; PD-L1 reverse primer, 5′-CA CAGTAATTCGCTTGTAGTCG-3′; GAPDH forward primer, 5′-GTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3′; GAPDH reverse primer, 5′-ACCACCTTCTTGATGTCATCAT-3′。

四、免疫組織化學染色

取75例NSCLC患者手術切除樣本，經包埋后制成石蠟塊，并用切片機切成4 μm厚的薄片。采用免疫組化(SP法)測定NSCLC腫瘤組織、癌旁組織及淋巴結(距離腫瘤組織5 cm以上)標本中XAGE1A蛋白表達。簡要操作如下：切片二甲苯-梯度酒精脫蠟至水，洗凈和抗原修復后，加入雙氧水阻斷過氧化物酶，封閉15 min，再用Ultra V Block封閉背景，洗凈后加入XAGE1A抗體(1 ∶100 稀釋)孵育過夜，繼以一抗增強劑和二抗孵育，DAB顯色。顯微鏡下見黃褐色斑時加入ddH2O充分沖洗停止顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片，烘干后鏡下觀察。

五、結果判斷

按照既往報道，XAGE1A為癌癥/睪丸抗原家族成員，故將胞質內出現淡黃色至棕黃色染色顆粒的細胞視為陽性。XAGE1A蛋白表達水平定性分析根據細胞染色強度和染色細胞所占面積的乘積計算。染色面積：陽性范圍≤10%計1分，10%～50%計2分，50%～80%計3分，80%以上計4分。染色強度：無陽性染色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。上述免疫組化評分，由2名病理科醫師采取雙盲方式進行，并綜合結果進行評判。

六、統計學分析

使用SPSS 25.0 軟件進行分析。RT-qPCR中腫瘤組織與癌旁組織的XAGE1A或PD-L1相對表達量輸入SPSS 25.0軟件數據庫，計量資料表示為均值±標準差，均為雙側檢測，數據經對數轉換后，經正態性檢驗數據呈正態分布，采用t檢驗分析；XAGE1A與臨床病理特點關系采用卡方檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier 法并經Log-Rank 檢驗，腫瘤組織與癌旁組織的XAGE1A與PD-L1免疫組化評分使用Kruskal-Wallis秩和檢驗；XAGE1A與PD-L1表達量關系使用pearson相關性分析。P<0.05 認為差異有統計學意義。

結 果

一、XAGE1A mRNA在NSCLC腫瘤(tumor)組織和癌旁(para-tumor)組織中的表達

獲取75例NSCLC患者腫瘤與癌旁組織檢測XAGE1A表達水平并進行配對比較，RT-qPCR結果顯示，XAGE1A mRNA在NSCLC組織中平均表達水平高于癌旁組織(見圖1a)。

二、XAGE1A 與PD-L1 mRNA在NSCLC組織中的表達關系

對75例NSCLC患者的腫瘤組織進行XAGE1A 與PD-L1 mRNA檢測，RT-qPCR結果顯示，XAGE1A 與PD-L1mRNA表達水平存在正相關關系，相關系數R=0.2647(見圖1b)。

圖1 XAGE1A和PD-L1在NSCLC不同類別組織中的mRNA表達及相關性。a： 分別為XAGE1A和PD-L1在癌旁組織與腫瘤組織中的mRNA表達；b： 為75例患者腫瘤組織中XAGE1A和PD-L1表達相關性。注：**P<0.01

三、NSCLC腫瘤及其癌旁組織中XAGE1A和PDL1蛋白表達情況

免疫組化結果顯示，XAGE1A 蛋白在腫瘤組織、癌旁組織中均定位于細胞核，陰性表達不著色，陽性表達呈淡黃、棕黃至棕褐色(見圖2a、b)；此外，XAGE1A蛋白在PD-L1(-)組織中細胞核基本不著色，多為低表達，PD-L1(+～)組織中細胞核出現棕黃至棕褐色顆粒，表達為陽性(見圖2c、d)。NSCLC組織中XAGE1A 蛋白總陽性數為64例(85.3%)高于癌旁組織22例(29.3%)(P<0.001)；XAGE1A 蛋白在PD-L1陰性表達的NSCLC腫瘤組織中總陽性數為18例(66.7%)，低于PD-L1陽性表達的NSCLC腫瘤組織的46例(95.8%)(P<0.001)(見表1,2)。

表1 XAGE1A在NSCLC不同類型組織中的蛋白表達

表2 XAGE1A與PD-L1在配對腫瘤組織中的蛋白表達

圖2 XAGE1A在NSCLC不同類別組織中的蛋白表達 a為癌旁組織，XAGE1A無明顯表達，b為NSCLC腫瘤組織，XAGE1A在結腸癌細胞胞核中呈強陽性表達，c為PD-L1(-)的腫瘤組織，XAGE1A無明顯表達，d為PD-L1(+)的腫瘤組織，XAGE1A在部分腺體腫瘤細胞胞核中呈強陽性表達(放大倍數均為400×)。

四、XAGE1A 蛋白與NSCLC臨床病理特點的關系

XAGE1A蛋白表達與患者的TNM 分期、分化程度、吸煙史和遠處轉移有關，其中TNM Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有吸煙史、遠處轉移患者XAGE1A蛋白陽性率高于所對應項目的非上述分類陽性率(P<0.05)；而XAGE1A蛋白表達與年齡、性別、淋巴結轉移以及病理類型無關(P>0.05)。PD-L1蛋白表達水平與NSCLC臨床病理特點的關系與XAGE1A蛋白表達情況相同，也與患者的TNM 分期、分化程度、吸煙史和遠處轉移有關(P<0.05)(見表3)。

表3 XAGE1A蛋白與NSCLC臨床病理特點的關系

五、NSCLC組織中XAGE1A 蛋白表達與預后的關系

納入研究的75名NSCLC患者的3年總生存率為21.78%(95%CI: 2.12～4.25%)，XAGE1A 陽性表達患者的3年生存率為26.35%(95%CI: 2.11～4.09%)，XAGE1A陰性表達患者的3年生存率為8.27%(95%CI: 2.44～4.87%)，XAGE1A 陰性表達患者的生存時間低于XAGE1A 陽性表達患者(P=0.0264)。隨訪3年中，兩組患者的生存曲線(見圖3)，XAGE1A 陽性患者生存率明顯高于陰性患者，且XAGE1A 陽性表達患者生存期明顯長于陰性表達者，表明XAGE1A的表達水平可作為NSCLC患者的重要預后監測指標(見圖3)。

圖3 XAGE1A陽性(High)和陰性(Low)表達患者的生存曲線

討 論

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因。非小細胞肺癌是肺癌主要類型，其包括多種組織學亞型，包括腺癌、支氣管肺泡癌、鱗癌、間變性和大細胞癌[13]。盡管過去幾十年來在肺癌治療方面取得了技術上的進步，但診斷后的五年總生存率仍為20%。以PD-L1為靶點的免疫治療是近二十年來肺癌領域發展最快的治療方法之一，其有效延長了患者OS，但不適用于少數PD-L1低表達、耐藥患者，因此探索免疫治療合適的協同診療靶標是提高免疫治療療效的重要問題。XAGE1A作為癌癥/睪丸抗原(CTAs)基因家族成員，在多種腫瘤中存在表達，例如尤因氏肉瘤、黑素細胞瘤、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺泡橫紋肌肉瘤和某些上皮腫瘤中[9, 11, 14-15]。XAGE1A位于X染色體上，其在某些癌癥患者中還觀察到了針對XAGE1A的血清反應性[16]，這表明XAGE1具有免疫原性。XAGE1高表達誘導的CD4和CD8 T細胞反應，促使患者產生體液免疫和細胞免疫[17]，故有學者指出XAGE1有望作為靶向免疫治療的潛在標志物和作用靶點用于NSCLC和前列腺癌的治療當中。目前關于XAGE1相關研究國內外多集中在轉錄本XAGE1B上，周清等[18]發現30例肺癌組織中，XAGE1B基因表達陽性率為40%(12/30)，而30例癌旁正常肺組織不表達該基因；腺癌中基因表達陽性率明顯高于其他病理類型(61.1%vs 8.3%,P=0.015)，可優先選擇該基因作為肺腺癌免疫治療靶點。周清等[19]發現非小細胞肺癌中VEGFR-2與XAGE1B基因表達呈正相關，XAGE1B表達陽性并且VEGFR-2高表達的患者可能是免疫療法與抗血管生成療法聯合治療的合適人群。但國內關于XAGE1A在NSCLC患者樣本中表達水平及其與PD-L1表達關系尚未有文獻報道。

本文通過對院內2017年到2020年75例NSCLC患者進行研究，發現NSCLC腫瘤組織相較癌旁組織中XAGE1A與PD-L1 mRNA與蛋白表達率均升高，且二者表達存在正相關性。XAGE1A和XAGE1D蛋白分別由81和69個氨基酸組成，它們共有相同的氨基酸末端，最高至32個氨基酸。一些報道表明[20]，來自肺癌患者的血清與XAGE1A反應，提示XAGE1即含有核定位信號，也存在于細胞外空間。本研究經免疫組織化學染色法，發現NSCLC組織中XAGE1A 蛋白總陽性數為64例(85.3%)高于癌旁組織22例(29.3%)；XAGE1A 蛋白在PDL1陰性表達的NSCLC腫瘤組織中總陽性數為18例(66.7%)，低于PDL1陽性表達的NSCLC腫瘤組織的46例(95.8%)。通過病理特征分析，發現XAGE1A與PD-L1蛋白在TNM Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有吸煙史、遠處轉移的患者中陽性表達率更高，但與年齡、性別、淋巴結轉移以及病理類型無顯著關系。已有研究證明，XAGE1可增強腫瘤細胞對腫瘤抗原的加工和呈遞過程，增加MHC-I分子的產生水平，從而直接激活腫瘤特異性T細胞應答[21]；通過構建過表達XAGE1基因的小鼠腫瘤模型，Xie等[22]發現IFN-γ分泌增加、IL-6分泌減少，樹突狀細胞增加且特異性T細胞免疫活性增強，上述表現可能是NSCLC中XAGE1A高表達促進患者自身免疫激活的原因之一。進一步生存分析結果則提示XAGE1A 在NSCLC腫瘤組織陽性表達患者的生存時間高于XAGE1A 陰性表達患者。鑒于XAGE1A與PD-L1存在顯著相關性，本研究結果有利于指導XAGE1A作為PD-L1治療的判斷標準和協同治療的靶標之一，有望用于NSCLC治療。

綜上所述， XAGE1A與PD-L1在NSCLC腫瘤組織表達均升高，但與NSCLC病理類型無顯著關系，XAGE1A陽性率與PD-L1陽性率呈正相關。XAGE1A 呈高表達患者的生存時間越長，提示XAGE1A 對NSCLC可能存在保護作用，有望成為NSCLC的免疫治療潛在分子靶點。