宏基因組二代測序在肺部感染診治的臨床價值

馮玲 熊佳麗 易榮 劉毅

肺部感染是臨床常見的呼吸道疾病，發病率高，是我國乃至全球范圍內感染相關性疾病死亡的主要原因[1]。尤其隨著臨床上癌癥治療、器官移植中免疫抑制劑的使用以及艾滋病等疾病導致的免疫受損患者增多，肺部感染有增加趨勢，早期針對性的抗病原學治療，是患者獲得有效治療的前提。但常規檢測方法的陽性率不高，加上臨床上經驗性抗感染治療，使得其陽性率進一步降低，顯然不能滿足臨床的需求，從而為肺部感染的診斷及治療帶來了難題[2-3]。宏基因組二代測序(Metagenomic next-generation sequencing, mNGS)是新興的一種病原體檢測方法，通過對標本中的所有微生物進行測序，根據不同微生物的序列數，進行結果判讀，有效識別致病病原體，具有覆蓋面廣、周期相對短等優點，因此近年來吸引了眾多研究者的目光[4]。本研究以住院期間完善了mNGS檢查的肺部感染患者為研究對象，回顧性分析患者的臨床資料，從不同患病人群、不同病原體等層面出發，旨在探究mNGS在肺部感染病原學診斷的臨床應用價值。

資料與方法

一、臨床資料

本研究收集2018年1月至2020年7月在株洲市中心醫院住院期間行mNGS檢查的59例肺部感染患者的臨床資料。其中男43例(72.88%)，女16例(27.12%)，年齡15～91歲，平均年齡61.90±18.44歲。病例納入標準：(1)臨床診斷為肺部感染，診斷標準：1.肺炎相關臨床表現：1)新近出現的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病癥狀加重，伴或不伴膿痰、胸痛、呼吸困難及咯血；2)發熱；3)肺實變體征和/或聞及濕性啰音；4)外周血白細胞計數>10×109/L或<4 ×109/L，伴或不伴細胞核左移。2.胸部影像學檢查顯示新出現的斑片狀浸潤影、葉或段實變影、磨玻璃影或間質性改變，伴或不伴胸腔積液。符合第1條中任何1項及第2條[5]。(2)住院期間完善BALF-mNGS，送檢標本符合mNGS要求，同時還使用了常規方法進行檢測。排除標準:臨床資料不完整。

二、研究方法

1 臨床資料收集：通過我院電子病歷系統收集入選患者的一般信息(姓名、性別、年齡、基礎疾病、既往用藥史)、住院期間BALF-mNGS及其他病原學檢測方法的結果(如：培養、涂片、G實驗、GM實驗、免疫學檢測等)，治療前后的臨床癥狀、影像學檢查及炎癥指標(血常規、血沉、C反應蛋白、降鈣素原)。

2 mNGS檢測方法：臨床采集的標本，均送至華大基因公司進行檢測，基于宏基因二代測序技術，對樣本中微生物核酸序列進行分析，通過與數據庫中已有微生物的核酸序列進行比對，從而對微生物進行鑒定。檢測過程包括：核酸提取、文庫構建、測序、信息分析、報告解讀等。

3 致病原確定方法：(1)常規方法致病原確定方法：細菌、真菌、結核等菌體的致病原檢查診斷金標準為培養；病毒診斷的金標準：核酸檢測陽性。(2)mNGS致病原確定方法：mNGS的致病原確定方法：① 對于細菌(不包括分枝桿菌)、病毒和寄生蟲：mNGS鑒定出物種水平的覆蓋率比其他任何微生物高出10倍；② 真菌：mNGS鑒定出的微生物其覆蓋率比其他任何真菌高5倍，對于曲霉菌，以屬嚴格序列數 (SMRNG)或種嚴格序列數(SMRN)≥2 為陽性；③ 結核分枝桿菌當至少1個序列被映射到物種或屬水平時被認為是陽性的[6-7]。

本研究符合醫學倫理學標準，經中南大學湘雅醫學院附屬株洲醫院倫理委員會審查同意(批號：(2019)倫審(科)第(08045)號)。

三、 統計學方法

結 果

一、一般資料

符合入組標準的肺部感染患者共計59例，其中男43例，女16例，平均年齡61.90±18.44歲。無基礎疾病組的男性16例，女性9例，有基礎疾病的男性27例，女性7例，兩組間差異無統計學意義(P=0.188)。無基礎疾病組的年齡58.40±21.79歲，有基礎疾病組的年齡64.47±15.36歲，兩組間差異無統計學意義(P=0.240)(見表1)。

表1 入選患者基礎疾病情況

二、mNGS與常規方法陽性率比較

在59個病例中，BALF-mNGS檢測陽性59例(100%)，常規方法檢測陽性43例(72.88%)，BALF-mNGS的陽性率明顯較常規方法高(P<0.001)。并且無論是有基礎疾病，還是無基礎疾病，mNGS均較多種常規方法聯合(如痰涂片、痰培養、BALF培養、G實驗、GM實驗以及一些抗原、抗體檢測)的檢出陽性率高(P<0.05)(見表2)。

表2 BALF-mNGS和常規方法的檢出總陽性率比較[n(%)]

進一步我們對比了BALF-mNGS和BALF培養陽性率差別，BALF-mNGS的陽性率顯著高于BALF培養(P<0.001)，進一步分析無基礎疾病與有基礎疾病組的差別，發現兩組BALF-mNGS的陽性率均顯著高于BALF培養(P<0.001)(見表3)。

表3 BALF-mNGS和BALF培養陽性率比較[n(%)]

三、mNGS及常規方法的臨床采信率比較

在BALF-mNGS檢測陽性的59例中，其中采信的42例，mNGS結果未被采納的：其中11例病原體檢出序列數少，無法充分支持其為致病原；6例因病原種類多且分散，再結合臨床(病史、影像、癥狀等)，無法分辨致病菌、定植菌、污染菌。常規檢測方法陽性43例，臨床采信的21例；BALF-mNGS的臨床采信率高于常規方法(P<0.05)。聯合兩種方法采信的有47例，與單用常規方法檢測，采信率顯著高(P<0.01)，但與單用BALF-mNGS相比差異無統計學意義(P>0.05)(見表4)。

表4 BALF-mNGS和常規方法的采信率比較

隨后，我們對比了無基礎疾病及有基礎疾病組的BALF-mNGS的采信率，有基礎疾病組陽性例數有34例，其中采信的占25例，無基礎疾病的陽性例數25例，其中采信的17例，兩組之間采信率差異無統計學意義(P>0.05)。

四、mNGS對不同病原體的診斷價值

在59例肺部感染患者中，聯合BALF-mNGS和常規方法最后明確病原的有47例，其中診斷為細菌性肺炎的24例，病毒性肺炎0例，非典型病原體感染1例(肺炎支原體)；肺結核13例；真菌性肺炎3例(念珠菌2例，曲霉菌1例)；混合性肺部感染6例(細菌+真菌感染5例，病毒+真菌1例)。BALF-mNGS對細菌性肺炎的檢出率顯著高于常規方法(P<0.05)，但真菌、結核菌及混合性感染檢出率兩者間的差異無統計學意義(均P>0.05)。此外，在混合性肺部感染中，聯合mNGS和常規方法的檢測完整率較單用常規方法顯著高(P<0.05)(見表5)。

表5 BALF-mNGS和常規方法的不同病原體檢出率比較[n(%)]

討 論

肺部感染是好發于各年齡階段的呼吸道疾病，據統計分析，近年來呼吸道感染性疾病病原學的流行病學也發生了變遷，主要表現為：1)發病率增加2)主要菌種分布改變3)新型病原體出現4)耐藥率的增加；有些甚至出現混合性肺部感染，因此針對性的抗病原學治療，無疑是獲得有效治療的前提[8]。近年來關于mNGS的研究有許多，但作為一種新技術，其是否能替代常規病原學檢測方法，仍具有爭議[9]。

首先，我們初步評估了BALF-mNGS在肺部感染中的檢測陽性率及臨床采信率。目前國內外有研究證實了mNGS較培養、PCR等檢測方法的敏感性及特異性高[10-13]。我們的研究數據表明，BALF-mNGS陽性率高于BALF培養，并且其陽性率及采信率均較多種常規方法聯合高。此外，mNGS在有基礎疾病組及無基礎疾病組間的陽性率及采信率差別不大。實際上，mNGS往往多被用于有基礎疾病人群，尤其是合并免疫致損疾病的，因為往往免疫力低下患者肺部感染致病原更復雜、合并罕見病原體的幾率相對更大，治療難度也大。而mNGS能通過比較不同病原的相對序列數，幫助盡早篩選出可能的致病菌，早期識別混合性感染、罕見病原體以及新型病原體[6,14-15]。對于無基礎疾病組，盡管我們的數據顯示常規方法的陽性率不及mNGS，但該類患者大多為常見病原體、或者對經驗性治療佳，mNGS對于常見病原體的優勢并不顯著，并且不及常規檢測方法經濟。

其次，我們探討了mNGS對不同病原的診斷價值，綜合多項研究，mNGS對于常見菌的檢測效果較培養相比無明顯優勢，但對于少見病原體、病毒、結核菌、真菌、混合性肺部感染的作用更可觀[4,16-17]。我們的數據表明：mNGS檢出細菌的陽性率較常規方法高，對于真菌、結核分枝桿菌及混合性感染兩種方法檢出率相當，但對于混合性肺部感染，mNGS與常規方法聯合檢測更全面。這與他人的研究存在差異，綜合多因素考慮：1) 真菌及結核分枝桿菌在經試劑處理后，核酸的釋放量相對低，因此限制了mNGS的檢測效力；2) 結核分枝桿菌、真菌及混合性肺部感染檢出例數相對較少，不能全面的反映mNGS的檢測效率。綜合考慮，mNGS的病原體檢測能力較常規方法更可觀。但無論如何，mNGS對于真菌及結核分枝桿菌檢測的總體陽性率低，后期如何更進一步提高這種微生物的檢測陽性率，值得深入研究。

綜上所述，mNGS在肺部感染中能有效提高病原體的檢出陽性率及采信率，能早期較直觀的識別出致病原，對于混合性肺部感染，可將mNGS與常規檢測方法聯合，從而增加診斷的精準度。

本研究的不足：該研究為回顧性研究，樣本量有限，各組的樣本量相對不均衡，需擴大樣本量，同時盡量保持組間樣本量均衡，增加結果的準確性。