新生兒呼吸機相關性肺炎氣管導管尖端生物膜菌群分析及其臨床意義

黨曉平 胡小劍 鄭玲芳

呼吸機相關性肺炎(Ventilator associated pneumonia，VAP)為呼吸內科常見疾病，系指以往無肺部感染而在機械通氣>48h后出現的肺部感染，文獻報道VAP發病率約為43.1%，病死率約為51.6%[1]。近年來隨著我國新生兒急救醫學的快速發展，呼吸機在新生兒中的應用較為廣泛，文獻報道發達國家新生兒VAP發病率約為3.0%～8.1%，發展中國家約為30.6%[2]，新生兒VAP早期癥狀缺乏典型性，早期識別難度較大，而診治不及時易引起脫機困難和治療時間延長，對新生兒生命造成嚴重威脅[3]。近年來由于新生兒VAP的致病菌和臨床診治不同于一般的肺炎，且其病死率較高，國內外對新生兒VAP的研究日益重視[4-5]。鑒于此，本文通過臨床回顧性分析，探討新生兒VAP患兒氣管導管尖端生物膜菌群變化及其臨床意義，旨在為新生兒VAP的早期防治提供有價值的參考。

資料與方法

一、一般資料

回顧性分析，收集2016年6月～2020年6月在本院行呼吸機治療的新生兒65例臨床資料。其中男嬰41例(63.08%)，女嬰24例(36.92%)，日齡3～27d，平均日齡(11.06±1.28)d，早產兒47例(72.31%)、足月出生兒18例(27.69%)，出生體重：<2.5 kg 49例(75.38%)、≥2.6 kg 16例(24.62%)。

二、入選標準

1.診斷標準：符合《諸福棠實用兒科學》(第7版)[6]有關新生兒VAP的診斷標準：經機械通氣治療48h后新生兒發生肺部炎癥；體溫高于37.5℃，并且經呼吸道吸取的分泌物呈膿性，肺部能夠聞及濕啰音，而外周血象白細胞增多高于10×109/L；胸部X線片檢查，提示肺部存在浸潤性的陰影；支氣管分泌物能夠查及培養出的病原菌。

2.納入標準：住院時間>48h；機械通氣時間>48h；病例資料完整。

3.排除標準：合并嚴重先心病；存在彌漫性血管內凝血功能障礙；多器官功能衰竭；合并血液系統疾病；合并嚴重外科疾病；出生即存在嚴重感染性疾病。

三、研究方法

1.資料收集：收集病例VAP患兒一般資料，包含性別、胎齡、日齡、出生體重和機械通氣時間、分娩方式、呼吸機類型等。

2.標本采集：所有病例患兒在機械通氣治療后準備撤離呼吸機時，立刻收集其呼吸機氣管導管，采用75%酒精擦拭氣道導管外表面以排除導管外表面的細菌污染，應用無菌生理鹽水仔細沖洗導管以排除浮游菌和其他非生物膜部分。剪下導管末端約2cm，放置于PBS緩沖液5 mL中，渦旋振蕩2min后在100Hz的超聲處理20min后，再次應用旋渦振蕩2min以稀釋氣管導管表面的生物膜，對處理后的樣本，平均分為2份(分別用于生物膜細菌 DNA 提取和細菌培養)。

3.生物膜細菌 DNA 提取：應用Takapa細菌DNA提取試劑盒對生物膜細菌中DNA進行提取，操作步驟：將保存好的生物膜處理液在高速離心(12000rpm/2min)后丟棄上清液，而后加500μl的Buffer BS重懸細菌胞體，加入50μl的20mg/mL Lysozyme并充分混勻，37℃水浴1h(每隔15min混勻一次)，在上述液體中加200μl的Buffer GB及200μl無水乙醇充分混勻。將Spin Column置于Collection Tube上，把上步混勻后的液體轉移至SpinColumn 中，以 12000 rpm 離心 2 min，棄去濾液。在Spin Column中加入500 μl的Buffer WA，經12000 rpm 離心1 min后丟棄去濾液。在Spin Column中沿其管壁四周加700 μl Buffer WB，經12000 rpm 離心1min后，棄去濾液。將Spin Column置于EP管上，懸空于Spin Column膜中滴加30μl Elution Buffer，在室溫下靜置5min。12000 rpm 離心 2 min 以洗脫膜上的DNA。將獲得的DNA原液置于-20℃保存備用。

4.基因檢測：將所得的細菌DNA原液于冰上解凍，2μl于NanoDrop2000 上檢測濃度和純度，據此將所有待測樣本濃度均一以行后續實驗。16s rRNA 基因V3-V4區PCR分為兩個部分，首先是對待測標本進行預實驗，預實驗成功后進一步行帶有Barcode測序接頭引物行PCR。16s rRNA基因V3-V4區普通PCR的引物如下：上游引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；下游引物806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR反應參數：95℃預變性3min，95℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸45sec，72℃終末延伸10min，共循環27次。同時進行Miseq 高通量測序檢測，經過PCR檢測后，DNA片段得到擴增形成DNA簇，再將這些擴增產物線性化形成單鏈DNA，加入帶4種熒光標志的dNTP和特殊的DNA聚合酶，使每個循環只合成一個堿基并檢測其堿基配對時釋放的熒光信號，讀取序列信息，以獲取模板DNA堿基序列。

5.病原菌培養：對置入無菌容器內封閉保存的標本于30min內送檢，采用美國BD公司提供的細菌培養儀(型號BACTEC9120)進行細菌培養，借助于全自動微生物鑒定儀(美國BD公司，VITEK-2 Compact型)對病原微生物進行鑒定，實驗過程嚴格按照無菌標準要求進行，并遵循《全國臨床檢驗操作規程》(第4版)[7]。

6. 質量控制：所有納入患兒的病歷資料均源于本院兒科診治的新生兒VAP，日齡均不足28d，患兒所有信息均由資質護士如實填寫，資料真實無誤。采用質控菌(如肺炎克雷伯菌ATCC 700603和金黃色葡萄球菌ATCC 29213等)進行質量控制。

四、統計學方法

統計學軟件SPSS20.0分析研究數據，性別和分類等計數資料采取例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，logistic回歸分析氣管導管尖端生物膜中主要菌群分布與新生兒VAP發生的關系。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、呼吸機治療新生兒的流行病學分析

65例新生兒VAP，VAP胎齡<28周、出生體重<2.5kg、機械通氣時間>10d、母體妊娠方式為剖宮產、呼吸機類型為有創占比較高(見表1)。

表1 呼吸機治療新生兒的流行病學分析[n(%)]

二、生物膜細菌DNA中16S rRNA基因V3-V4區PCR檢測和測序結果分析

本研究65例患者均成功提取細菌DNA，預實驗中均成功擴增出目的條帶，如圖1所示。

圖1 圖中“1～18”表示目的條帶，均與500bp相接近，“19”為陰性對照，無條帶

三、65例VAP患兒氣管導管尖端生物膜菌群種類分析

65例VAP患兒共89份氣道導管尖端微生物膜，共分離出菌株71株，分離率79.77%(95%CI：69.66%～88.76%)；其中革蘭氏陰性菌占總檢出的85.92%，銅綠假單胞菌占比32.39%、肺炎克雷伯桿菌占比28.17%，而革蘭氏陽性菌占總檢出的14.08%，鏈球菌占比5.63%(見表2)。

表2 65例VAP患兒氣管導管尖端生物膜菌群種類分析

四、不同特征VAP患兒氣管導管尖端生物膜菌群主要種類分布比較

不同特征VAP患兒氣管導管尖端生物膜菌群主要種類分布概率比較差異無統計學意義(P>0.05)(見表3)。

表3 不同特征VAP患兒氣管導管尖端生物膜菌群主要種類分布比較

五、氣管導管尖端生物膜中主要菌群分布與新生兒VAP發生的關系分析

采用logistic回歸分析提示導管生物膜銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和鏈球菌是VAP發生的獨立影響因素 (P<0.05)(見表4)。

表4 氣管導管尖端生物膜中主要菌群與新生兒VAP發生的關系分析

討 論

新生兒VAP不僅影響機械通氣治療患兒的臨床效果，甚至威脅患兒生命健康，新生兒 VAP是目前備受關注的公共健康衛生問題[8]。研究發現在機械通氣治療期間，呼吸機氣管導管可為致病菌進入原先無菌條件下的氣道和肺部提供了通道，值得注意的是細菌一旦進入呼吸機氣管導管，則可快速黏附于氣管導管的表面從而形成生物膜，生物膜被視為是細菌的一種不同于浮游狀態的復雜表現形式，主要由細菌分泌的胞外多糖、蛋白及核酸等形成，其對抗菌藥物的耐藥性較高[9-10]。文獻報道超過90.0%機械通氣患者氣管導管尖端可在一定程度上形成生物膜，而這些附著于呼吸機氣管導管表面的生物膜一旦受到氣流動力影響，可致生物膜脫離氣管導管表面而彌散至下氣道或深部肺組織，是引起新生兒VAP發病的一項重要影響因素[11]；國外一項研究報告指出70%生物膜中病原菌的存在與下呼吸道分泌物細菌相同，說明生物膜的存在或與VAP的發生有一定關聯[12]。而進一步明確新生兒VAP患兒氣管導管尖端生物膜菌群變化及其與VAP發病的關系，或有助于臨床上更為深入了解新生兒VAP的致病原因。

圖2 樣本稀釋曲線

本次研究結果65例新生兒VAP，VAP胎齡<28周、出生體重<2.5kg、機械通氣時間>10d、母體妊娠方式為剖宮產、呼吸機類型為有創占比較高，胎齡<28周、出生體重越低的新生兒，機體發育尚不成熟，抵抗力相對較低，在機械通氣過程中一旦病原菌侵襲發生VAP的風險高，而機械通氣時間越長往往意味著外源性病原菌感染機會越高，而呼吸機有創則預示著患兒機體創傷更大，出現感染風險越高，故認為出生體重低、機械通氣時間長及有創機械通氣的新生兒更易發生VAP，與國內學者周艷芳等[13]報告的基本相符。此外，本結果還顯示65例VAP患兒氣道導管尖端微生物膜中共分離出菌株71株，分離率高達79.77%(95%CI：69.66%～88.76%)，其中革蘭氏陰性菌占比85.92%，以銅綠假單胞菌(32.39%)和肺炎克雷伯桿菌(28.17%)較為常見，而革蘭氏陽性菌占比14.08%，以鏈球菌(5.63%)最為常見，與上述周艷芳等報道的VAP患兒呼吸道分泌物標本中病原菌培養結果顯示的革蘭氏陽性菌以表皮葡萄球菌、糞腸球菌為主而革蘭氏陰性菌則以鮑曼不動桿菌等為主的觀點存在差異，說明氣管導管生物膜中病原菌分布有所變化，常規經驗用藥并不適用于新生兒VAP治療中。本結果還證實不同流行特征VAP患兒氣管導管尖端生物膜菌群主要種類分布概率比較，差異無統計學意義，此外進一步相關性分析發現，氣管導管生物膜中銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和鏈球菌的檢出率與VAP 的發生存在明顯的關系，初步提示氣管導管生物膜病原菌群的存在與VAP發病密切相關，氣管導管生物膜其內的微生物存在多樣性，并且這些微生物間可相互作用促進VAP的發生發展[14]。研究證實銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和鏈球菌常存在氣管導管內，其可促進細菌生物膜的形成，各病原菌可相互作用增加毒力[15]，導致新生兒VAP發生風險顯著增高。

綜上所述，本次研究初步證實了新生兒VAP氣管導管尖端生物膜菌群分布特點，并明確了銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和鏈球菌常存在氣管導管內，是促進細菌生物膜形成的關鍵菌株，在新生兒VAP發生中起著重要的作用，有望為新生兒VAP防治提供新的靶點。