非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測在養殖環節的應用

陳天慧 王立嬌 劉洋 王世奇 張賀朋 張晶新 顧英俊 崔新燃 王保中

（北京市房山區動物疫病預防控制中心 102488）

非洲豬瘟(African Swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。具有病程短和死亡率高等特點，比傳統豬瘟病毒致病性更強。自2018年我國發生非洲豬瘟疫情以來，給養豬業造成極大的經濟損失。利用熒光PCR檢測非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)是當前診斷最有效的手段，對基層疫情排查、養殖場安全監管、屠宰場宰前檢測有重要意義[1]。在開展非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測過程中，經過長期大量試驗，總結出檢測環節常見問題及預防措施，為基層獸醫實驗室開展日常非洲豬瘟病毒檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

活豬無菌采集EDTA抗凝血或口鼻拭子（pH7.2PBS緩沖液)；病死豬無菌采集肝、脾、淋巴結等組織樣品；環境樣品采集畜舍墻面、地面、污水、料槽；車輛樣品采集運輸車輛的車頭、車尾、車廂、輪胎等。飼料樣品覆蓋豬場及飼料廠不同飼養階段。2019年1月至2020年12月，在房山區生豬養殖過程中共采集23230份樣品，其中組織樣品25份，抗凝血1805份，口鼻拭子20630份，飼料樣品66份，環境樣品542份，車輛樣品162份。

1.2 檢測儀器及試劑

qTower3熒光定量PCR儀，analytikjena公司產品；NPA-32P全自動核酸提取儀，杭州博日科技有限公司產品；HR40-ⅡA2生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司產品；NU-543-300S生物安全柜，美國Nuaire公司產品；SQ510C全自動高壓滅菌器，重慶雅瑪拓科技有限公司產品；SSW-420-2S型電熱恒溫水槽，上海博迅實業有限公司產品；Sorvall ST16R高速冷凍離心機，Thermo Fisher公司產品。

核酸提取試劑盒，購自杭州博日科技有限公司；非洲豬瘟病毒實時熒光PCR檢測試劑盒，購自青島立見診斷技術發展中心。

1.3 檢測方法

參照非洲豬瘟病毒實時熒光PCR檢測試劑盒說明書進行。

1.4 結果判定

陽性對照的Ct值應﹤35且出現特異性擴增曲線，陰性對照應無Ct值或Ct值≥40且無特異性擴增曲線，試驗結果有效。被檢樣品Ct值﹤40且出現特異性擴增曲線，判為陽性；當無Ct值或Ct值≥40，判為陰性。

2 結果及常見問題分析

所有樣本的Ct值為“無”或Ct值≥40，結果表明，所有被檢樣品均為ASFV抗原陰性。由于基層獸醫實驗室應用熒光PCR等分子生物學方法開展大規模病原學檢測較少，在檢測過程中會出現試驗不成立、假陽性、假陰性、復測結果不一致等4種常見問題。

2.1 試驗不成立

陽性對照無曲線或Ct值﹥35，出現這種情況的主要原因是陽性對照反復凍融。陰性對照Ct值﹤40，主要原因是實驗室環境污染或加樣過程中人為操作造成陰性對照污染。

2.2 假陽性

出現假陽性的主要原因有檢測功能區域設置不合理、人員物品流向不合理、樣品提取與試劑配制未在獨立的生物安全柜中進行、檢測人員操作不規范、核酸氣溶膠污染、樣品或提取模板間交叉污染、試驗結束后清潔消毒不徹底等[2]。

2.3 假陰性

造成假陰性的原因主要涉及樣品問題和人為因素兩個方面。樣品問題主要存在于抗凝血，肝素會抑制PCR反應，應用EDTA抗凝管，樣品量過少會導致EDTA在全血溶液中濃度過大，對擴增結果造成干擾，導致假陰性。此外Ct值﹥35的檢測樣品受環境、操作手法等影響較大，且隨著保存時間延長可能導致復檢結果陰性[3]。人為因素包括試驗操作不當漏加樣品、人工標記的記號阻礙熒光信號收集、重復復測等。

2.4 復檢結果不一致

引起復測結果不一致的原因有檢測試劑反復凍融、同一樣品滅活前后Ct值不同、樣品前處理不離心勻漿導致病毒分布不均勻、溶血樣品血紅素含量差異大、混樣量太多。

3 討論

熒光PCR檢測方法具有靈敏度高，特異性強，在生豬養殖環節被廣泛應用于非洲豬瘟日常排查和疫情診斷。在檢測過程中，由于PCR試驗受實驗室環境、樣品種類、人為操作、檢測試劑和檢測儀器等多種因素影響，使得PCR試驗出現上述4種問題。筆者通過查閱大量文獻及結合平時的工作經驗，從“人、機、料、法、環”5個方面提出預防措施，加強獸醫實驗室建設，做好實驗室生物安全，提高檢測人員技術水平，減少PCR試驗誤差。

3.1 人

加強檢測人員的培訓考核工作。所有從事PCR檢測人員應經培訓考核合格上崗，掌握PCR的原理、方法，按照標準及作業指導書的要求進行規范操作，熟悉相關儀器設備性能，并能按照標準規定的程序熟練操作，避免因人為操作失誤造成試驗誤差和污染。在ASFV檢測的樣品制備階段，樣品需60℃水浴滅活30min，樣品處理必須在生物安全柜或負壓實驗室進行處理。加液（樣本、反應體系)時，應先離心勻漿，小心開蓋以防液體飛濺或產生氣溶膠。加樣時應最后加陽性并設置對照，防止樣品污染。

3.2 機

實驗室應配備滿足檢測需求（包括樣品處理、試劑制備、核酸提取、PCR擴增、數據處理與分析)的設備和設施。儀器設備應通過計量認證，確保檢測數據的準確性。不同區域的儀器設備不能通用，特別是樣品處理的生物安全柜與試劑配置的生物安全柜不能混用。生物安全柜在試驗前進行紫外消毒30min，試驗過程中有污染隨時擦拭消毒；試驗操作結束后及時對操作區域及使用過的移液器等物品進行化學消毒，繼續使生物安全柜通風至少10min，過濾試驗過程中產生的氣溶膠污染，通風結束再次紫外消毒30min。

3.3 料

試驗所需的檢測試劑和生產的廢棄物要妥善保管及處置。檢測試劑應做到先進先出，專人保管。陽性標準品應按照檢測樣品量合理分裝，避免反復凍融。二級生物安全實驗室不具備保存ASFV病料的生物安全條件，當天檢測樣品需及時高壓處理。所有含有核酸耗材不能高壓消毒的應直接放入含消毒劑的自封袋內密封處理。擴增產物嚴禁暴露于空氣中，避免產生氣溶膠污染。液體廢棄物需經過消毒液浸泡處理后密封，固體廢棄物需在生物安全柜中密封包裝，經表面消毒后再移出，交醫療廢棄物處理公司處置。

3.4 法

加強獸醫實驗室體系建設，制訂質量與生物安全管理手冊、程序文件、作業指導書、質量記錄表格。相關內容一定要具有科學性、合理性、可操作性，確保檢測有法可依，有據可循，隨時查閱，方便操作。

3.5 環

按照分子生物學試驗要求，非洲豬瘟病原學檢測需嚴格實驗室分區，設置試劑配制區、核酸提取區、核酸擴增區、PCR產物分析區，做到區區分離，人和物單向移動，防止交叉污染的發生。實驗室內的樣本液和擴增產物是氣溶膠的主要污染源，實驗室要經常通風換氣，保證通風設備運行良好。嚴格執行實驗室消毒制度，每次試驗前后用消毒液擦拭工作臺面及可能接觸到核酸的冰箱、門、窗等把手處，用75%酒精擦拭儀器設備，再用紫外燈照射整個實驗區域不少于30min。

4 結論

通過對2019～2020年房山區養殖環節中采集的23230份樣品采用非洲豬瘟實時熒光PCR方法進行檢測，結果均為ASFV抗原陰性。經過大量試驗總結出檢測環節易出現試驗不成立、假陽性、假陰性、復測結果不一致等4種常見問題，從“人、機、料、法、環”5個方面提出相關預防措施，為基層獸醫實驗室開展日常非洲豬瘟病毒檢測提供參考。作為動物疫病防控部門，我們要根據防控形勢的變化，有針對性地加強非洲豬瘟養殖環節的檢測，積極開展疫情分析評估和預報預警，有效提升風險防范能力和水平，堅決打好打贏非洲豬瘟疫病防控戰。