基于siRNA經皮給藥系統用于皮膚疾病治療的研究進展*

任會紅，張瑜娟，閔衛平，

(南昌大學1.藥學院；2.基礎醫學院免疫學教研室；3.免疫與生物治療研究所；4.江西省免疫與生物治療重點實驗室，南昌 330006)

小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)是一類長度為20～25個核苷酸的RNA分子，通過RNA干擾(RNA interference，RNAi)的方式調節基因表達，使靶信使RNA進行特異性沉默，從而實現基因治療的目的[1]。皮膚作為人體的最大器官，是siRNA最易到達的靶器官，臨床試驗報告以細胞毒性T淋巴細胞相關抗原 -4[2]和程序性細胞死亡-1[3]為靶點的siRNA抑制劑可用于皮膚黑色素瘤患者的臨床治療，為皮膚相關疾病的臨床治療提供了新的研究方向。

經皮給藥系統(transdermal drug delivery systems，TDDs)是藥物透過皮膚，經毛細血管吸收進入人體血液循環，產生局部或全身治療作用，實現預防或治療疾病的給藥途徑[4]。經皮給藥作為新穎的給藥方式，具有局部靶向性好，患者依從性高，給藥可控可持續且無肝臟首關效應等優勢，使得siRNA經皮給藥系統成為皮膚疾病治療研究的熱點[5]。然而，由于siRNA具有強親水性和電負性，易被核酸酶降解及難以突破皮膚角質層屏障作用等缺陷，限制了其應用。雖然皮內注射為siRNA的應用提供了有效的給藥途徑，然而由于劇烈的疼痛感、有限的給藥點和給藥次數，使其應用仍受到極大的限制[6]。

近年來，納米粒(nanoparticles，NPs)由于具有合適的粒徑、良好的生物相容性、可控的藥物釋放性以及較低的細胞毒性等優點，成為遞送siRNA經皮給藥的有效載體[7]。筆者對納米載體攜載siRNA在皮膚疾病治療中的應用進行綜述，以期為皮膚疾病治療提供更安全、有效、實用的給藥手段。

1 siRNA經皮給藥的新型納米載體

1.1脂質納米粒(lipid nanoparticles，LNPs) LNPs由于其粘附于皮膚上形成單層疏水膜，進而引起閉合效應，可防止水分流失、角質細胞堆積減少和角質細胞間隙擴大，從而促進siRNA的吸收和皮膚滲透，現已被廣泛用于基因藥物、抗腫瘤藥物、蛋白質和多肽等藥物的經皮遞送載體[8]。為增強LNPs攜載 siRNA 的經皮遞送，BOAKYE等[9]利用新型吡咯烷脂質制備陽離子脂質納米粒載體，負載厄洛替尼和白細胞介素(IL)36α siRNA局部用于C57BL/6小鼠銀屑病樣斑塊的治療，能明顯增加厄洛替尼的皮膚保留率和IL36α siRNA的皮膚滲透率。TRAN等[10]利用新型陽離子脂質納米粒裝載靶向V600EBRAF和Akt3基因的siRNA，將其局部用于裸鼠黑色素瘤模型中，結果顯示siRNA可被有效遞送到皮膚病變的黑色素瘤細胞中，降低V600EBRAF和Akt3基因的表達，進而為靶向抑制早期或侵襲性皮膚黑色素瘤提供了有效途徑。

1.2介孔二氧化硅納米粒(mesoporous silica nano-particles，MSNs) MSNs不僅具有較大的比表面積、較高的孔隙率及可調的孔徑結構等特點，還可以通過表面修飾或包覆功能性物質，實現對腫瘤細胞的靶向性，并且其穩定的框架結構可以保護和遞送核酸分子，以達到基因治療的目的。因此，被認為是遞送核酸分子、蛋白質、化療藥物的優良載體[11]。MORRY等[12]用聚乙烯亞胺和聚乙二醇對MSNs進行表面修飾后，作為靶向熱休克蛋白47(heat shock proteins 47，HSP47) siRNA的遞送載體；其帶正電荷的聚乙烯亞胺中和了siRNA的負電荷，增強了siRNA的穩定性，聚乙二醇層保護siRNA免被核酸酶降解；體外纖維化模型研究中，MSNs有效地遞送了靶向HSP47的siRNA；通過小鼠硬皮病模型進行體內評價，顯示給予HSP47 siRNA納米粒治療后能有效地將HSP47在皮膚中的表達降低到正常水平，進而增強皮膚抗纖維化作用。LIN等[13]利用細胞可裂解的陽離子聚合物表面功能化的MSNs作為遞送siRNA的載體，并進行了體內外評價，結果顯示功能化的MSNs具有較高的正電荷，對siRNA具有良好的結合能力，并增強了siRNA的細胞攝取率。

1.3聚合物納米粒(polymeric nanoparticles，PNs) PNs可與帶負電荷的siRNA通過靜電結合而自發形成siRNA-聚合物復合物，極大降低了siRNA表面的負電荷，提高了其穩定性；同時聚合物本身對siRNA的保護和屏障作用，減少了siRNA的降解和細胞毒性，因此成為一種被廣泛用于siRNA遞送的新型藥物載體[14-15]。CUN等[16]通過雙重乳液溶劑蒸發法制備載有siRNA的乳酸-乙醇酸聚合物納米粒，不僅具有良好生物相容性和可降解性，而且極大增加了siRNA在乳酸-乙醇酸納米粒子中的負載率和包封率。DESAI等[17]合成了一種具有環狀吡咯烷頭部基團和聚乳酸-乙醇酸陽離子兩親性基團的新型可生物降解的脂質聚合物納米載體(CyLiPn)，攜載腫瘤壞死因子α(TNF-α)siRNA用于治療慢性皮膚炎癥疾病；小鼠體內的生物分布研究顯示CyLiPn可有效地將TNF-α siRNA遞送到深層真皮環境中；由咪喹莫特誘導的銀屑病斑塊樣模型治療結果顯示，攜帶TNF-α siRNA的CyLiPn能夠顯著降低TNF-α、核因子(NF)-κB、IL-17、IL-23和Ki-67基因的表達。

1.4金納米粒(Au nanoparticles，AuNPs) AuNPs由于具有獨特的光學特性、良好的生物惰性、局部表面等離子共振效應以及高效的光熱轉換能力等特點，已被用于多種藥物及核酸分子的遞送載體[18]。有研究[19]表明將AuNPs良好的等離子體特性與RNAi途徑相結合，通過對AuNPs進行功能化修飾后，在近紅外激光照射下，可使siRNA在特定部位通過熱等離子體機制以可控方式釋放。由于AuNPs本身具有相對惰性及近紅外激光在生物組織中具有較大的穿透能力，被認為是遞送siRNA的理想載體。ZHANG等[20]開發了一種新型功能化金納米載體FA-AuNRs，用于介導siRNA靶向沉默腫瘤BRAF突變基因，再聯合光熱效應用于治療黑色素瘤；體內外實驗表明， FA-AuNRs對BRAF siRNA具有較高的裝載率，并且提高其在血清中的穩定性，增強了對皮膚的滲透性，對C57BL/6小鼠黑色素瘤樣模型進行治療后， 顯著抑制了BRAF基因的表達和黑色素瘤的生長。

2 納米載體聯合其他途徑協同增強siRNA的經皮給藥

2.1聯合細胞穿透肽(cell penetrating peptides，CPPs) CPPs具有顯著的跨膜轉導能力，可有效轉運如siRNA、核酸和蛋白質等多種生物活性分子穿透細胞膜進入細胞內，保證活性分子正常發揮作用且不產生毒性反應[21]。因此，納米載體聯合CPPs可提高納米載體的細胞攝取和跨膜轉導能力，增強siRNA在經皮給藥中的遞送效果。寡聚精氨酸(R8)和反式激活轉錄蛋白(transactivative transcription protein，TAT)多肽是一類高正電荷的陽離子型CPPs，可與負電荷的siRNA通過靜電作用相互絡合。RUAN等[22]開發了一種基于細胞穿透肽R8納米復合物的BRAF siRNA給藥系統，用于局部靶向治療黑色素瘤；體內外實驗表明，R8/BRAF siRNA納米復合物能夠顯著增強BRAF siRNA的轉染效率，降低BRAF基因的表達，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制黑色素瘤的生長。PETRILLI等[23]以細胞穿透肽TAT功能化的新型液晶納米分散體為載體，負載TNF-α siRNA局部用于化學誘導的炎癥動物模型中；體內外研究表明，經TAT修飾后，提高了納米粒的細胞轉染效率和吸收效率，并且提高了siRNA的皮膚滲透率，顯著抑制促炎細胞因子TNF-α的表達。

2.2聯合離子導入(iontophoresis，IP) FUKUTA等[24]研究表明，親水性大分子(如siRNA和納米顆粒)在弱電流[0.3～0.5 mA·(cm2)-1]下通過IP經皮滲透到皮膚中，在皮膚組織內傳遞并隨后發揮其功能。IP[0.4 mA·(cm2)-1]給藥后，異硫氰酸熒光素標記的IgG抗體在皮膚內廣泛可見，并從表皮層延伸至真皮層。在咪喹莫特誘導的銀屑病模型大鼠中，抗體也通過IP傳遞到炎癥的皮膚組織中。LABALA等[25-26]用殼聚糖包裹的AuNPs負載STAT3 siRNA，在IP作用下，以B16-F10小鼠黑色素瘤細胞為模型進行體外研究；結果表明IP增強了負載siRNA的AuNPs的皮膚滲透性，黑色素瘤細胞通過內吞機制迅速攝取負載STAT3 siRNA的AuNPs-CS納米載體，抑制STAT3蛋白的過度表達；以黑色素瘤荷瘤小鼠為模型進行體內研究，使用0.5 mA·(cm2)-1弱電流通過IP局部給藥后，顯示腫瘤體積百分比和腫瘤質量顯著減小，STAT3蛋白表達顯著降低。

2.3聯合微針 大量研究證實，微針介導納米顆粒的經皮給藥可顯著增加皮膚對NPs的通透性。KUMAR等[27]評估了經微針預處理后，在體內外促進納米粒皮膚滲透的效果及微生物感染的潛在風險；研究表明用微針對小鼠皮膚進行預處理，使粒徑230 nm的固體脂質納米粒在其表面與卵清蛋白結合，可實現皮膚滲透并誘導抗卵清蛋白抗體反應，且在允許納米顆粒滲透的同時降低了細菌和病毒的滲透。WANG等[28]建立了一種包含透明質酸基質和MSNs包覆的納米粒包埋微針體系，利用MSNs殼加載靶向轉化生長因子β1型受體的siRNA并對其進行保護，微針體系被植入皮膚后，溶解并釋放納米粒，通過皮膚組織擴散后，被真皮層的成纖維細胞吸收內化，釋放siRNA抑制結締組織生長因子mRNA的表達，進而抑制成纖維細胞的過度增殖和膠原的過度生產，阻止瘢痕異常發育。

3 納米載體攜載siRNA在皮膚疾病中的應用前景

皮膚疾病的種類繁多，發病機制復雜，治療效果和預后均不理想。一些皮膚炎癥如銀屑病或特應性皮炎的發生發展過程涉及多種促炎細胞因子和趨化因子的影響；致死率較高的皮膚癌如黑色素瘤或鱗狀細胞癌的發病過程中，某些特定基因會高度表達或發生基因突變，進而引起病癥惡化。而siRNA作為有效的生物標記物和治療靶點，在皮膚局部給藥后，可以直接調節皮膚中的靶細胞，發揮治療作用。因此，siRNA經皮給藥為皮膚疾病的臨床研究提供了新的方向。

siRNA經皮給藥的有效靶點包括：①BRAF是黑色素瘤中最常見的突變基因，該突變通過絲裂原激活蛋白激酶途徑激活下游信號，這為黑色素瘤的治療提供了一個有吸引力的靶點[29]。②林簡等[30]研究表明在人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞中，siRNA干擾N-myc下游基因的表達，可以抑制磷酯酰肌醇3激酶/絲氨酸激酶信號通路轉導，進而抑制癌細胞生長，促進癌細胞凋亡，為皮膚鱗狀細胞癌治療提供了新的靶點。③LIO等[31]研究表明抑制皮膚鱗狀細胞癌異種移植小鼠腫瘤中TGFβR-1的表達，可降低腫瘤生長速度，因此TGFβR-1可作為RNAi治療皮膚鱗狀細胞癌的有效靶點。

但必須看到，攜載siRNA經皮給藥系統用于皮膚疾病治療的研究中尚存在多個未解決的問題：一是需篩選最佳siRNA序列，進而保證其在靶向性沉默和疾病治療方面具有最佳效果。二是siRNA經皮給藥的納米載體所涉及的長期安全性和可能產生的皮膚刺激及其他不良反應等問題，如在siRNA給藥的研究中，大多數臨床試驗是基于脂質體納米粒，而其他納米粒載體MSNs、AuNPs或PNs仍存在生物相容性差和不可生物降解等問題。三是IP常伴有疼痛感，微針所導致的開放性傷口也容易引起皮膚病毒和細菌感染。所以，未來研究的重點仍是為不同類型的皮膚疾病患者提供有效且安全的siRNA經皮給藥系統，以保證在有效給藥和安全性之間達到適當的平衡。

4 結束語

RNAi作為一種新的基因敲除機制，可通過siRNA對皮膚疾病的特定靶基因進行特異性調節，從而實現基因治療的目的。此機制不僅具有較高的特異性，而且顯著降低了全身毒副作用，因此具有廣泛的臨床應用價值和潛力。而TDDS不僅在動物實驗中顯示改善了siRNA的生物利用度，而且可提高患者的依從性，為基于siRNA的皮膚疾病治療提供了一種安全的給藥系統。隨著對siRNA經皮給藥納米載體的不斷深入研究，與納米載體介導的RNAi技術的逐漸完善和成熟，將會為皮膚疾病的治療提供更安全、更有效、更實用的載藥手段。