1例羊源肺炎克雷伯菌和大腸桿菌混合感染的診斷

馬 鳳

（甘肅省靖遠縣畜牧獸醫技術服務中心，甘肅靖遠 730900）

近些年來，肺炎克雷伯菌逐漸在羊身上被發現，發展速度較快，對羊養殖產生了重要影響。大腸桿菌又稱為大腸埃希菌，這種細菌在腸道內正常存在，但一些血清型的大腸桿菌會引發動物機體發生抵抗力低下，導致腹瀉或敗血癥的發生[1～3]。本研究對這兩種細菌混合感染進行分析，以便獸醫能更好地對患病山羊進行治療。

1 材料與方法

1.1 一般材料

患羊病癥為眼部紅腫，在放牧的過程中出現神經性問題，不吃青草。本次實驗中應用的試劑為血平板培養基、腸桿菌科細菌生化鑒定管（青島高科技工業園海博生物技術有限公司）、麥康凱類瓊脂培養皿，使用16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit試劑盒（寶生物工程有限公司生產），大腸桿菌診斷血清（天津生物芯片診斷）。

1.2 方法

1.2.1 對山羊病變組織急性處理

對山羊病變的部位進行剖檢，病羊剖檢部位出現肺部淤血伴有壞死，心外膜增厚，肝臟腫大伴有壞死，病羊腹腔壞死，心臟外的薄膜厚度增加，其他組織有缺血情況，病羊腸道內出血。

1.2.2 細菌培養

對病羊體內細菌進行分離培養，采用接種環對病羊體內病變的器官內的組織進行挑選，使用麥康凱的平板進行劃線處理，將培養皿放置在恒溫箱中，溫度維持在37℃，培養時間16 h以上。

1.2.3 染色鑒定

染色鑒定的方法主要采用革蘭氏染色。對培養皿中的菌落進行挑選，將疑似患病的組織菌落固定在一處，采用結晶初染，滴加碘液，滴加時間控制在1 min，滴加乙醇和沙黃水溶液，時間控制在0.5 min，上述操作完成后進行吸干和鏡檢操作。

1.2.4 生化方面的試驗

抽取2只病羊血樣進行測驗，診斷腸桿菌科，主要采用玻璃板對菌株1、2進行相關鑒定。

1.2.5 對血清型進行鑒定

將病羊中的菌株1、2使用大腸桿菌進行診斷，主要采用血清玻璃板凝集的方式進行鑒定。

1.2.6 16S rRNA 測定基因序列的方法

主要方法步驟為：將純化完成的菌液煮沸，提取DNA，并將其作為模板，采用16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit試劑盒對其中通用的物質進行擴充，測定基因序列，并將測試結果上傳至數據庫中進行全面分析。

1.2.7 藥敏試驗

使用滅菌棉簽將純化完成的菌液均勻涂抹在培養皿中，再使用滅菌鑷子將藥敏紙片貼于培養皿上，隨后將其放置于培養箱內，溫度保證在37℃，保存1 d左右，培養完成后，使用小尺測量培養菌圈的直徑。

2 結果

2.1 培養皿中細菌呈現的形態

菌株1在培養皿中通過麥康凱進行培養形成圓形狀態，表現為光滑狀態，且菌株培養較為濕潤，邊緣較為齊整，呈現紅色狀態。菌株2呈現狀態與菌株1相同，但呈灰白色，且顏色較淺，菌株較小。

2.2 革蘭氏染色情況

使用光學顯微鏡觀察菌株1發現，呈粉紅色直桿菌，且直桿菌呈現菌體較大的情況，菌體兩端為鈍圓，且成對出現。菌株1和菌株2在革蘭氏染色處理下情況相同。

2.3 兩組生化試驗情況對比

菌株1中，與伯杰氏細菌進行對比，發現其屬于大腸桿菌。菌株2與肺炎克雷伯菌情況相同（見表1）。

表1 兩組菌株生化試驗情況

2.4 血清型鑒定和16S序列測定

對菌株1和菌株2進行血清型鑒定，經大腸桿菌診斷，其血清及玻璃板凝集試驗出現大腸桿菌為菌株1，血清型為020，菌株2PCR的擴增使用產物為1800 bp。

2.5 兩組藥敏試驗結論

對菌株1、2兩組進行24種藥物藥敏反應，測試結果顯示：大腸桿菌對頭炮素類藥物有藥敏反應，對苯唑啉高敏感（見表2）。

表2 兩組菌株藥敏情況（mm）

3 討論

肺炎克雷伯氏菌可引發羊等動物肺部炎癥，造成腦出血。因此，獸醫應及時進行實驗室檢測，進行確診，采取科學的防治措施，降低養殖戶的經濟損失。這種細菌檢測方法主要通過細菌培養進行，如采用16s rDNA進行診斷準確度較高，但需在實驗室進行，有一定的局限性。

大腸桿菌是一種傳染性較高的病菌。當羊舍衛生條件不達標、生長環境差、羊舍溫度控制不好、飼喂不科學導致羊胃腸功能下降時可引發病變，傳播速度快，傳播能力強，一旦發病影響較大[4]。

本研究通過藥敏試驗發現兩組細菌情況較為相似；通過血清監測發現血清型O2O對羊致病性等于0；藥敏試驗發現，兩種細菌對喹諾酮類藥物敏感性較強，可采用諾氟沙星藥物對患羊進行預防或治療。治療羊源性感染時，應根據藥敏試驗的敏感程度，選擇敏感性較強的藥物進行治療，保證治療效果。