山東地區1例肉雞養殖場大腸桿菌噬菌體的分離和解譜鑒定

魏甜甜

（青島市即墨區畜牧業發展服務中心，山東青島 266200）

大腸桿菌是引發雞腸道疾病的主要致病菌，嚴重危害畜禽健康，影響畜禽產量和質量，給養殖業帶來巨大的損失[1～3]。隨著細菌耐藥譜不斷擴展，研究畜禽新型抗菌藥物對解決耐藥性問題至關重要。噬菌體治療有明顯的優勢，未來對其應用價值的研究將會成為畜禽抗菌藥物研究的重點。

本試驗以從山東地區某肉雞場發病肉雞體內采集的24株致病性大腸桿菌為宿主菌，從墊料中分離噬菌體，并檢測分離到的噬菌體的裂解譜，選取其中的寬噬噬菌體進行保存及研究，為治療雞源大腸桿菌病奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病料采集

菌種：山東地區某肉雞場發病肉雞體內采集的24株致病性大腸桿菌為宿主菌。

1.2 方法

1.2.1 復蘇培養菌種

用細菌接種環分別挑取適量-20℃甘油凍存的24株致病性大腸桿菌菌液，在SS瓊脂培養基上分區劃線分離單個菌落，將培養皿倒置于37℃恒溫箱中培養16～24 h。

制備菌懸液：在已滅菌的超凈臺上，分別挑取粉紅色單個菌落，接種到5 ml營養LB肉湯的試管中，于空氣浴振蕩器37℃ 200 rpm過夜培養得菌懸液，置于4℃冰箱內保存備用。

制備混合菌懸液：分別從已培養好的5 ml菌懸液中各取100 μl菌液加入到盛有 LB肉湯20 ml的三角瓶中，空氣浴振蕩器37℃200 rpm振蕩培養6 h得混合菌懸液，4℃保存備用[4]。

1.2.2 處理墊料

將墊料5g加入生理鹽水10 ml中，并用玻璃棒攪拌至均勻，呈糊狀備用（有條件的可以用篩糞器將其中雜質篩除）。

1.2.3 噬菌體的分離與鑒定

制備噬菌體增殖液：取墊料2 g加入上述混合菌懸液中，充分混合均勻，于空氣浴振蕩器中37℃ 160 rpm培養10 h，用于噬菌體的分離培養。

本試驗采用雙層平板法對分離到的噬菌體進行鑒定，將已配好2%的底層瓊脂熔化后冷卻至50℃左右，傾注入無菌培養皿中，待凝固后倒置以備用。

將上述噬菌體增殖液靜置20 min后，取出15 ml 10000 rpm離心5 min，將其中的上清液用無菌針頭式濾器過濾除去細菌碎片，得到無菌濾液，將得到的濾液裝于EP管中備用。各取100 μl菌懸液分裝于24個EP管中，再各加上100 μl上述濾液，用力振蕩使菌懸液與噬菌體濾液充分混勻后，40℃水浴15 min，再將所得的混合液立即加入到已融化好的上層營養瓊脂中（55℃），用手快速搓試管使混合懸液與上層瓊脂混勻后，快速對號倒入已凝固好的底層瓊脂平板上，旋轉平皿輕搖平板使上層營養瓊脂分布均勻，待上層營養瓊脂凝固后，倒置放入37℃的恒溫培養箱培養3～5 h后，第一次觀察有無噬菌斑，觀察完畢后，再次培養至6～8 h，第二次觀察有無噬菌斑及其噬菌斑的大小形態。結果表明，如果濾液中存在著噬菌體，既可在平板上形成蠶蝕狀的空斑，與灰白色的菌苔形成對比，即為噬菌斑[5～6]。

1.2.4 噬菌體的純化

通過雙層平板法我們可以在平板上得到肉眼可見，大小不一，形態各異，圓形、清晰、透明的噬菌斑。因此，需要對分離到的噬菌體進行純化。操作過程如下：將鑷子在酒精燈上滅菌，待冷卻后，挑取單個噬菌斑置于盛有1 ml無菌生理鹽水的EP管中，40℃水浴30 min后4000 rpm離心10 min，取出上清得到噬菌體的浸出液繼續采用雙層平板法。重復上述步驟3～5次，得到大小均勻一致、透明的噬菌斑。

1.2.5 噬菌體的增殖

通過雙層平板法得到的噬菌體的效價很低，需要進行噬菌體的增殖，增加噬菌體的效價。

制備噬菌體浸出液：用已滅菌的鑷子挑取單個噬菌斑于500 μl的生理鹽水中，40℃水浴30 min后4000 rpm離心10 min，過濾之后得噬菌體的浸出液。

選用LB肉湯液體培養基對噬菌體進行增殖，操作過程如下：各取200 μl的單一菌懸液和200 μl的噬菌體浸出液加入到盛有5 ml的LB肉湯液體培養基中，分別相應編號，空氣浴振蕩器37℃ 160 rpm振蕩培養3～4 h，期間每隔半個小時觀察1次，可見菌懸液和噬菌體浸出液的混合液由渾濁變清亮的整個過程。待混合液變澄清后裝入到10 ml的無菌離心管中，4000 rpm離心10 min。

取出上清液與等量的菌懸液混合均勻加入60%LB甘油4℃保存以備用[7～9]。

1.2.6 噬菌體裂解譜的測定

本試驗采用雙層平板法對噬菌體進行24株致病性大腸桿菌裂解譜的測定。所用方法如下：分別挑取24株大腸桿菌的單菌落接種于盛有5 ml的LB肉湯液體培養基中，37℃ 160 rpm振蕩培養10 h，得各株大腸桿菌的菌懸液。

為保證結果準確性，需對噬菌體濾液進行倍比稀釋。方法如下：分別取90 μl的生理鹽水于3只無菌的EP管，標號1、2、3。取10 μl的噬菌體濾液于標號為1的EP管中，用微量移液器充分混合均勻后取10 μl的混合液于標號為2的EP管中，重復上述步驟。

各取20 μl菌懸液和20 μl噬菌體混合液37℃溫箱中孵育15 min后，加入到已融化好的上層瓊脂培養基中（55℃）中，手搓試管，使混合懸液與上層培養基混勻，混勻后迅速對號倒入已準備好的底層瓊脂培養基上，輕搖平皿使上層培養基鋪滿平板，凝固后37℃倒置培養3～6 h，觀察結果。

2 結果與分析

2.1 分離噬菌體及測定裂解譜

通過利用雙層平板法從墊料中分離到兩株噬菌體：BP13、BP14，噬菌斑的形態、大小見圖1。

圖1 噬菌斑的形態

由圖1可以看出，噬菌體BP13，BP14均可以形成邊緣整齊透明的噬菌斑。BP13、BP14噬菌體經過培養4～6 h后可得到直徑約1 mm的噬菌斑。

2.2 噬菌體裂解譜

采用雙層平板法對噬菌體進行裂解譜的測定，采用LB肉湯液體培養基的方法噬菌體BP13、BP14的裂解譜進行鑒定（見表1）。

表1 2株噬菌體裂解譜的測定結果

采用雙層平板法，以24株致病性大腸桿菌為宿主菌，噬菌體BP13對致病性大腸桿菌的裂解譜最為廣泛，能完全裂解3號、7號、8號、9號、10號、21號、23號、24號、25號、34號、39號、44號，能使27號大腸桿菌的雙層平板上有噬菌斑，不能使其LB肉湯液體培養基變澄清，寬噬率為50%。BP14能完全裂解21號，22號，寬噬率為8.33%，能使11號、18號、29號、34號大腸桿菌的LB肉湯液體培養基變澄清，不能使其雙層平板上出現噬菌斑。噬菌體BP14及BP13裂解大腸桿菌的時間有差異（見表2）。

表2 2株噬菌體澄清所需時間

由表2可知，采用LB肉湯液體培養基可觀察到2株噬菌體的增殖速度不同，噬菌體BP13比BP14裂解速度快。同一噬菌體對不同的致病性大腸桿菌的裂解時間也不同。BP13能夠使34號、39號致病性大腸桿菌快速裂解，裂解速度最快。BP14能夠使21號致病性大腸桿菌快速裂解，裂解速度最快。

3 討論

3.1 關于噬菌體的分離

通過對噬菌體進行多次的分離后，在雙層瓊脂平板上得到了透明規則，直徑約為1 mm的噬菌斑。分離噬菌體時需要注意事項如下：

（1）采集墊料：需要注意不能只取單只雞的或只取自一堆，應取相隔較遠不同排或是不同雞舍的墊料，因為單只雞體內含有噬菌體的可能性非常小，同時這樣也避免了只是取到同一種噬菌體的可能性，大堆墊料中環境復雜細菌的種類多因此含有不同種噬菌體的概率也比較大[10～11]。（2）墊料處理：初步處理時最好把墊料放入無菌容器內，并加入生理鹽水攪成糊狀后，用篩糞器或紗布將墊料中的大顆粒去除，防止初次取增殖液的時堵塞移液槍。同時使墊料中的噬菌體分布均勻，避免加樣的時候所加入的墊料中不含有噬菌體。（3）將墊料2 g加入到混合菌懸液中振蕩搖勻，輕輕吸取上層液體，離心后要輕拿輕放。離心后的液體注意一定要注意過濾，防止分離噬菌體時雙層平板上可能出現雜菌，影響試驗結果。（4）初次分離得到的噬菌斑可能形狀各異，大小不一。當出現疑似噬菌斑時，需要經過驗證加以確定。用無菌生理鹽水浸潤可疑噬菌斑30～45 min，使噬菌體游離出來，離心之后再做雙層平板。當在雙層平板上再次出現相似噬菌斑時，才能證實從墊料中分離到了相應的噬菌體。當分離到相應噬菌體后，選取大小適合的噬菌斑進行純化，才能得到理想效果的噬菌斑。

3.2 關于噬菌體裂解譜的測定

雙層平板法從墊料中分離得到2個噬菌斑，經過裂解譜的測定發現這是兩株不同的噬菌體。再進一步用LB肉湯培養基檢驗發現這兩種噬菌體的生長時間，以及裂解大腸桿菌的程度都不相同，可以確定這是兩種不同的噬菌體。

由于本試驗的目的是篩選出寬噬噬菌體，還需要對分離到的噬菌體進行純化和增殖。經過鑒定發現，BP13號噬菌體可以完全裂解3號、7號、8號、9號、10號、21號、23號、24號、25號、34號、39號、44號致病性大腸桿菌，裂解率達50%。BP14號噬菌體可以完全裂解21號、22號致病性大腸桿菌，裂解率達8.33%。

4 小結

從墊料中分離出兩株不同噬菌體，并利用雙層平板法和24株致病性大腸桿菌對分離到的噬菌體進行裂解譜的測定。BP13可裂解12株致病性大腸桿菌型細菌，寬噬率為50.0%；BP14可裂解2株致病性大腸桿菌型細菌，寬噬率為8.33%。