斑馬魚視覺損傷和視神經再生的研究進展

陳維昕，金 銘，張 旭

?KEYWORDS:zebrafish; eye disease; optic nerve regeneration; retina regeneration

0引言

與哺乳動物不同的是，斑馬魚具有強大的再生潛能，視神經受損后神經節細胞可再生軸突，并在斑馬魚有利的神經系統微環境中迅速生長實現神經功能的恢復。斑馬魚被證明能夠再生受損的視網膜，再生的關鍵是Müller膠質細胞，可對視網膜損傷做出一系列的反應，并去分化為祖細胞，繼而分裂分化為再生所需的視網膜神經元類型。在哺乳動物中，視網膜的損傷導致Müller細胞反應性神經膠質增生，這是典型的神經膠質反應，通常不利于視力恢復。在嚙齒動物中，Müller膠質細胞可以響應N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-aspartic acid, NMDA)損傷和生長因子刺激而形成新的神經元，但數量非常有限[1]，而且Müller膠質細胞的再生潛力隨生長而減弱[2]。兩棲動物的視網膜再生主要是以視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)轉分化的形式實現[3]。斑馬魚視網膜受損后，Mapk/Erk，Gsk3β/β-catenin和Jak/Stat3等信號通路被激活，與再生相關的細胞骨架蛋白，轉錄因子以及軸突生長指導因子等的表達被上調，在此過程中，轉錄因子Ascl1a被證明在各信號通路的聯結和調節起關鍵作用。此外，有體外研究發現，人的Müller膠質細胞在適當條件下可表現祖細胞特性，可產生光感受器和視網膜神經節細胞(retinal ganglion cell, RGC)，將其移植到受損的嚙齒動物視網膜可表現出一定的修復能力[4]。本綜述歸納了斑馬魚視網膜、視神經再生相關機制的最新研究，這些研究有助于為不可逆視網膜視神經變性疾病的細胞替代療法提供新的治療思路。

1斑馬魚模型在眼病中的應用

斑馬魚屬脊椎動物，其組織系統結構和功能與人相似，且基因高度保守[5]，其器官組織有巨大的再生潛能，目前已有大量關于斑馬心臟、腎臟等在再生方面的研究[6-9]。而同樣作為視覺系統研究的熱門動物模型，斑馬魚主要具有以下三方面的優勢：(1)斑馬魚的胚胎和幼魚通體透明，體外發育，易于在顯微鏡下觀察操作，發育為成魚后體積較小(約4cm)，眼部所占比例較大，視覺系統與其他脊椎動物相似，更重要的是具有優于嚙齒動物、雛雞等其他視覺系統模式動物的視覺神經系統的再生潛能[10]；(2)成本低，易于飼養，繁殖能力強，生長發育周期短等特點，適用于大樣本量的藥物篩選，遺傳發育篩選來評估眼病相關突變體[11]；(3)已建立有成功的視覺系統損傷方式，包括遺傳突變模型[12]，光損傷模型[13]，化學藥物損傷模型[14]，機械性損傷模型[15]以及缺氧模型[16]等。斑馬魚轉基因模型(rpe65a：nfsB-eGFP)用于研究RPE功能障礙和變性，對于與年齡相關的黃斑變性等疾病的研究有重要意義[17]。Cao等[16]利用斑馬魚建立出第一個與臨床眼病高度相關的低氧誘導的視網膜血管生成的成年fli-EGFP轉基因斑馬魚模型，vhl突變體則是另一種病理血管生成和血管視網膜病變的臨床相關模型[18]，且這兩種模型都可以潛在的用于篩選和評估與血管生成相關的藥物及其療效。斑馬魚irp2突變模型則模擬了近視和青光眼危險因素，為研究近視的遺傳原因和機制提供了有力依據[19]。值得一提的是，斑馬魚顯示出的視網膜細胞(包括神經節細胞)的再生能力使其成為研究神經節細胞及神經節細胞軸突存活相關疾病的不二之選，并且已經有不少的研究鑒定出在斑馬魚視網膜再生過程中必不可少的基因，我們將在后面的內容中進行簡單介紹。

2視神經軸突再生

2.1RGC感受損傷視神經損傷后可能會向周圍的神經膠質和神經元發出死亡信號，導致RGC選擇性死亡。大鼠視神經受損后30min內發出信號，并在6h內激活細胞死亡途徑信號通路，在視神經擠壓模型7d后損失20%的RGC[20]。而在斑馬魚視神經擠壓模型中幾乎所有的RGC都能幸存下來，并表現出驚人的軸突再生速率[21]。

2.2視神經軸突再生研究表明斑馬魚可以在視神經擠壓傷后5d內將RGC軸突再生至頂蓋[22]，在20～25dpi內恢復視覺功能[23]。影響軸突再生主要取決于兩個因素：軸突再生的微環境和神經元生長相關蛋白的表達[24]。

與哺乳動物不同，斑馬魚神經系統內似乎存在允許神經再生的微環境。Nogo-A，Sema3A，硫酸軟骨素在哺乳動物中樞神經系統參與抑制神經軸突的再生，但在斑馬魚體內，Nogo-A不僅被發現缺乏抑制域相關的序列[25-26]，而且可能具有促進軸突生長的作用[27]；Sema3A的兩個同源物在成年斑馬魚的病變視神經束中未檢測到表達[28]；而硫酸軟骨素免疫反應增加表明神經膠質瘢痕的產生，被視為神經再生失敗的證據，但在斑馬魚病變的神經中未發現其表達的上調[29]。斑馬魚視神經軸突再生的第二個原因是視神經變性后斑馬魚神經節細胞會迅速上調與生長相關的信號和蛋白，如軸突生長指導信號、細胞骨架蛋白、轉錄因子等。視神經受損3wk后，腱生蛋白-R在病變神經相鄰接結構中的表達上調，斑馬魚視神經節細胞還會通過接觸排斥機制來引導新添加和再生的視神經軸突；而降低腱生蛋白-R的表達會減少神經軸突的生成[30]。α微管蛋白1(tuba1)在視神經受損1d后上調達到峰值，生長相關蛋白43(gap43)在第4d達到最大值[20]，構成蛋白質復合物和信號轉導的中心微域支架蛋白Reggies-1a,-2a,-2b，轉錄因子KLF6a,KLF7a在軸突再生過程中表達均被上調,并且下調Reggies-1a,-2a,-2b會顯著抑制斑馬魚RGC軸突再生[31-32]。最新研究發現Jak/Stat信號也參與斑馬魚的視神經再生，IL-6家族的細胞因子，通過Gp130偶聯的受體，在視神經損傷后刺激視網膜神經節細胞中的Jak/Stat3信號傳導，并發現細胞因子CNTF，IL-11和Clcf1/Crlf1a均可以刺激視神經軸突再生[33]。

2.3視神經髓鞘化和功能恢復髓磷脂在中樞神經系統中由少突膠質細胞提供，為軸突提供營養和代謝支持，在神經元的正常功能中發揮關鍵作用[34]。視神經損傷后，L1相關基因，Contactin1b和髓磷脂蛋白零(P0)在少突膠質細胞中觀察到有表達，可能反映髓鞘再生[35-37]。最新的研究發現了一種新型的髓磷脂相關蛋白Claudin k，能在軸突周圍形成松散的包裹薄膜，成年斑馬魚視神經擠壓損傷后，Claudin k蛋白水平出現降低，在病變后4wk內恢復，此過程伴有視神經髓磷脂的降解與再生[38]，在斑馬魚視神經軸突切斷后20～25d，其視動反應迅速恢復，在損傷后80～100d，追趕行為(學習行為)也逐漸恢復[23]，這種視覺功能的基礎恢復和早期學習功能的恢復反映了再生視神經軸突正確的投射到頂蓋和突觸被精細化修飾的結果。

3 Müller膠質細胞主導的視網膜再生與主要的相關基因

與哺乳動物不同，斑馬魚被證明能夠再生受損的視網膜，再生的關鍵是Müller膠質細胞。Müller膠質細胞是一種星形膠質細胞，跨越從玻璃體表面到視網膜下間隙整個視網膜結構，除了行使與普通膠質細胞相似的神經元代謝與結構支持功能，離子緩沖，維持神經遞質穩態等基礎功能之外，最新研究發現Müller膠質細胞能夠引導光線通過視網膜的內部組織，并保留了傳播圖案中光圖案的空間分布[39]，并且還在視網膜損傷后充當視網膜干細胞的角色[40]。其特殊的解剖位置使其與視網膜每層神經元和鞘神經元及血管周圍的細胞外間隙相接觸，活躍地參與視網膜的正常生理活動和視網膜變性過程[39]。Müller膠質細胞是如何感受損傷，重編程過程中哪些信號分子發生明顯變化，有哪些主要信號通路參與損傷后再生，接下來我們將進行簡單的闡述。

3.1Müller膠質細胞對損傷的感受腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是視網膜細胞受損后由凋亡的視網膜神經元產生的誘導Müller膠質細胞增殖的第一個信號，TNF-α在受損后16h表達升高[41]，并且在損傷部位的Müller膠質細胞中檢測到肝素結合性表皮生長因子(heparin binding EGF,HB-EGF)表達量的升高，它們可能通過旁分泌或自分泌的方式將視網膜受損的信號傳遞給Müller膠質細胞，同時還作用于Mapk/Erk，Wnt/β-catenin，Jak/Stat3等信號轉導級聯刺激Müller膠質細胞去分化和增殖[42-43]。在這個過程中TNF-α被證明是Müller膠質細胞重編程和祖細胞形成所必需的，而HB-EGF可能通過EGFR和Mapk/Erk通路發揮擴增信號的作用誘導Müller膠質細胞最大化地去分化和增殖最大化[42]。HB-EGF在損傷后激活再生的必要性還需要進一步研究。

3.2Müller膠質細胞對損傷的反應大量的研究表明，轉錄因子Ascl1a在Müller膠質細胞整個去分化和增殖過程的各個信號通路中發揮關鍵的調節作用。視網膜損傷后4h內，Müller膠質細胞誘導了Ascl1a的表達[44]，Ascl1a上調與干細胞更新有關的mRNA結合蛋白Lin-28的表達。降低Lin-28可促進再生相關基因let-7的抑制，所以Ascl1a上調會促進Müller膠質細胞去分化[45]。此外受損視網膜中Müller膠質細胞以Lin28/Ascl1a依賴性方式表達信號轉導因子和轉錄激活因子Stat3(signal transducer and activator of transcription 3，Stat3)[46]，但它們復雜的調節機制還未闡明，可能存在調節回路，也有可能有其他的細胞因子參與作用。Sox2就是可能參與其中的因子之一，Sox2是成熟的神經元干細胞相關轉錄因子，可調節脊椎動物的神經發育和成年的神經發生[47]。最新的研究表明Sox2能使靜止狀態的Müller膠質細胞重新進入細胞周期并分化為神經細胞，并且Sox2具有誘導Ascl1a和Atoh7表達的能力，有趣的是，抑制Sox2的表達顯著降低Ascl1a表達，但它不影響Stat3表達[48]，而之前的研究表明下調Ascl1a顯著降低了Stat3表達[46]，這種差異可能是由Sox2敲低導致的，或者，有可能Sox2的丟失仍使Stat3上游的通路起作用。無論如何，Sox2在斑馬魚視網膜中差異性調節Stat3和Ascl1a的早期表達，表明Müller膠質細胞依賴性視網膜再生需要不同的信號通路。另外，Müller膠質細胞來源的神經元祖細胞后期持續增殖以及視錐細胞感光細胞的最大化再生中，都需要Sox2參與作用[48]。另一方面，Ascl1a不僅刺激信號途徑，還可以通過控制祖細胞形成和增殖蛋白質和miRNA的表達，例如Dkk，Notch，Insm1a等促進Müller膠質細胞去分化和祖細胞形成[42，49]。

最近有研究嘗試探索Müller膠質細胞增殖過程中DNA去甲基化的作用，下調去甲基化胞苷脫氨酶Apobec2a或Apobec2b，Müller膠質細胞的增殖反應顯著降低，有趣的是同時發現損傷依賴性的ascl1a及其靶基因誘導也被抑制，表明Ascl1a和Apobec蛋白之間也存在調節反饋環，且不依賴于Lin28，是獨立的信號傳導途徑[50]。再次證明了Ascl1a在Müller膠質細胞增殖過程調節各個信號通路的關鍵性作用，同時也暗示DNA脫甲基化可能是Müller膠質細胞重編程產生和再生反應的基礎。

3.3Müller膠質細胞損傷后再生經過重編程的反應性Müller膠質細胞的細胞核從INL遷移到ONL(此過程稱為運動核遷移)，并在ONL進行不對稱分裂，產生多能祖細胞，該多能祖細胞迅速分裂并以N-鈣黏著蛋白依賴性方式遷移到INL中，從而產生用于視網膜所需的神經元[51]，Mapk/Erk，Gsk3β/β-catenin和Stat等信號通路參與其中并促進祖細胞的形成[42,46,52-53]，但在反應性Müller膠質細胞運動核遷移過程中細胞黏附作用和細胞極性的變化及其分子機制，以及鄰近細胞膜表面感受分子的變化與祖細胞分化命運的關系還有待進一步闡明。目前有研究發現在機械損傷模型中，Notch信號抑制hb-egf和ascl1a基因表達以限制受損視網膜中增殖祖細胞的區域，可能控制祖細胞的擴增，卻不抑制最初的Müller膠質細胞分裂產生祖細胞的過程，同時Notch信號還參與祖細胞的分化，刺激神經膠質細胞的感光細胞形成[42]。在多能祖細胞進一步分化為視網膜所需神經元過程中，有研究表明下調Müller膠質細胞中Drgal1-L2表達會導致視桿感光細胞的再生減少，但不會影響損傷誘導的增殖和視錐感光細胞的再生[54]；此外，在選擇性損傷感光細胞的再生模型中，hspd1和mps1基因促進視錐感光細胞的再生[55]，但O-phospho-L-serine則起相反的作用[56]。這些基因之間的相互作用決定多能祖細胞的分化方向，但反應性Müller膠質細胞不能無限制地去分化為多能祖細胞，目前研究發現一些負性調控因子控制著反應性Müller膠質細胞退出細胞周期。Insmla是一種表現出雙相表達模式的轉錄阻遏物，對視網膜的再生至關重要，Insmla通過調節hb-egfa基因表達來幫助塑造反應性Müller膠質細胞的反應區域[49]，抑制細胞周期相關基因，并增強編碼細胞周期蛋白依賴性激酶(Cdk)抑制劑的基因p57kip2的表達來促進退出細胞周期進程[49]。此外，似乎存在Ascl1a-Insmla-dkk信號級聯[49]，它們聯結Müller膠質細胞再生過程的首尾，有助于Ascl1a和Insm1a的動態表達，實現整體和諧的視網膜再生。

4未來研究面對的問題和挑戰

視網膜再生從根本上是細胞的感受，細胞反應，細胞再生模式的選擇和形態的變化，再加上再生結局，視功能的恢復，這其中仍有許多問題尚未解決。目前的研究揭示在斑馬魚視網膜再生中，Ascl1a分子在Müller膠質細胞的細胞去分化和增殖，甚至Müller膠質細胞祖細胞退出細胞周期中都起著關鍵性的聯結作用，但各個通路之間是否存在一定的反饋作用，無數的分子和信號通路是如何在再生過程中被嚴格的調控聯系在一起，這些問題仍需進一步的研究。值得注意的是，目前對Müller膠質細胞祖細胞退出細胞周期的機制了解甚少，哪些分子信號會激活Müller膠質細胞的不對稱自我分裂，而不是誘導神經膠質瘢痕形成？為什么Müller膠質細胞保留其神經膠質特性并退出細胞周期，而神經膠質源性視網膜祖細胞分裂為子代細胞增殖并分化為神經元？目前研究已經發現的在退出細胞周期中起關鍵作用的Insmla，Notch，HB-EGF和Ascl1a為進一步探究Müller膠質細胞增殖分化命運提供重要的提示。

綜上所述，斑馬魚的視網膜再生研究建立在可靠的基礎上，進一步的研究將通過解決許多遺留的機制缺陷和與不同物種視網膜再生間的比較來構建出更完整的神經再生前景。更深入全面地了解斑馬魚的再生潛能與機制，旨在發揮人類Müller膠質細胞的再生潛力，并創造有利的微環境，以便對受損或患病的視覺系統進行功能性臨床修復。