溶血磷脂促進(jìn)奧沙利鉑誘發(fā)的急性周圍性疼痛

該研究的重要性聲明：一線細(xì)胞抑制劑奧沙利鉑可引起急性周圍性疼痛和慢性神經(jīng)病理性疼痛。前者與慢性神經(jīng)病理性疼痛有因果關(guān)系，但對其機(jī)制了解甚少。對奧沙利鉑注射24 h 后，神經(jīng)組織中的細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子和約200 種脂質(zhì)進(jìn)行了無差別的廣泛分析，揭示了LPC 18:1、LPC 16:0 和9,10-EpOME 在奧沙利鉑引起的急性疼痛中的關(guān)鍵作用。本研究首次證明LPC 18:1 有助于激活感覺神經(jīng)元中離子通道TRPV1 和TRPM8，并在體外周注射后引起機(jī)械性超敏反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)表明，LPC 介導(dǎo)的脂質(zhì)信號傳導(dǎo)與奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性周圍性疼痛有關(guān)。

1.背景介紹

化療后多發(fā)神經(jīng)病變 (CIPN) 是細(xì)胞抑制藥物高劑量所引發(fā)的不良反應(yīng)。奧沙利鉑是廣泛用于結(jié)直腸癌的一線治療藥物，可引起兩種不同類型的疼痛綜合征，即急性周圍性疼痛和慢性神經(jīng)病理性疼痛。Argyriou 等開展的一項(xiàng)大型臨床試驗(yàn)表明，高達(dá)89%的病人在奧沙利鉑治療后出現(xiàn)急性周圍性疼痛，80%患有周圍性疼痛的病人在奧沙利鉑治療后引發(fā)嚴(yán)重慢性神經(jīng)性病變的風(fēng)險(xiǎn)更高。

導(dǎo)致CIPN 產(chǎn)生的潛在分子機(jī)制仍知之甚少。Anand 等發(fā)現(xiàn)已知的配體門控離子通道：瞬時(shí)受體電位(TRP) 通道可能會(huì)促進(jìn)奧沙利鉑誘發(fā)的神經(jīng)性疼痛。TRP 通道可以被辣椒素 (TRPV1)、異硫氰酸烯丙酯(TRPA1) 和薄荷醇 (TRPM8)等化學(xué)物質(zhì)激活。Hohmann 等研究也證明，在病理生理?xiàng)l件下，由細(xì)胞因子、趨化因子和促炎性神經(jīng)肽以及內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)等炎性介質(zhì)引起的TRP 通道敏化和激活可能導(dǎo)致神經(jīng)源性炎癥和外周感覺神經(jīng)元活性增加，并且可能誘發(fā)CIPN 出現(xiàn)機(jī)械性超敏反應(yīng)。有趣的是，之前研究已經(jīng)證明了幾類信號脂質(zhì)，如類二十烷酸、亞油酸代謝產(chǎn)物和鞘脂等可促進(jìn)疼痛超敏反應(yīng)。

在本研究中，本文作者假設(shè)奧沙利鉑治療后早期發(fā)生神經(jīng)元可塑性和感覺神經(jīng)元活性變化。而這些神經(jīng)元活動(dòng)的改變可能會(huì)導(dǎo)致奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性周圍性疼痛引起機(jī)械性超敏反應(yīng)，并有可能增加周圍神經(jīng)系統(tǒng)后來發(fā)生慢性神經(jīng)性病變的幾率和嚴(yán)重性。

2. 結(jié)果

（1）奧沙利鉑誘發(fā)的急性疼痛后的機(jī)械閾值、細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子：為了研究奧沙利鉑的急性作用，本文作者在經(jīng)典的痛覺模型（3 mg/kg 腹腔注射）中通過動(dòng)態(tài)足底測試評估了分別用對照劑和奧沙利鉑處理的雄性和雌性小鼠的機(jī)械閾值。在腹腔注射奧沙利鉑和對照劑后2、4、6、24、26、48 和72 h 測定小鼠縮足反射潛伏期。與對照組小鼠相比，注射奧沙利鉑24 h 后雌雄小鼠發(fā)生機(jī)械痛敏反應(yīng)，可以維持至72 h。在機(jī)械痛閾值方面，不同性別小鼠間并未觀察到任何差異。同樣，奧沙利鉑注射后24 h 和72 h 之間也無差異。使用冷板實(shí)驗(yàn)和丙酮實(shí)驗(yàn)，研究了急性奧沙利鉑治療后對于冷痛感的影響，但治療后未檢測到任何冷超敏性反應(yīng)。

（2）脂質(zhì)與奧沙利鉑引起的急性疼痛有關(guān)：趨化因子、生長因子和細(xì)胞因子的篩選結(jié)果顯示，奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性周圍性疼痛與經(jīng)典的炎性疼痛在機(jī)理上有所不同。Piomelli 等研究證實(shí)內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)會(huì)引起疼痛超敏反應(yīng)，為了可以同時(shí)檢測數(shù)百種不同的脂質(zhì)，接下來對注射奧沙利鉑和對照劑24 h 后小鼠DRG、坐骨神經(jīng)和脊髓進(jìn)行了廣泛無差別的LC-QTOFMS 篩選。分析表明，在注射奧沙利鉑的小鼠DRG 中，游離脂肪酸增加。接下來用LC-MS/MS 檢測了由多不飽和游離脂肪酸(20:4)合成的前列腺素的濃度。此外，已知這些脂質(zhì)會(huì)在炎癥過程中增加，并可能導(dǎo)致疼痛超敏反應(yīng)。與細(xì)胞因子和趨化因子類似，注射奧沙利鉑后前列腺素類沒有增加。相反，驚奇地觀察到在注射奧沙利鉑的雄性小鼠DRG 中前列腺素PGE2、PGD2 和血栓烷B2b (TXB2) 顯著降低。雌性小鼠在注射奧沙利鉑后24 h 后，前列腺素PGE2 和PGD2 均顯著降低，但TXB2 的濃度無顯著變化。

本研究觀察到在注射奧沙利鉑24 h 后，DRG中的游離脂肪酸亞油酸(18:2)含量大大增加。因此通過LC-MS/MS 檢測了雌雄小鼠注射奧沙利鉑24 h 后DRG 中的氧化亞油酸代謝物(OLAMs)的濃度。發(fā)現(xiàn)9,10-EpOME 均顯著增加，而其代謝物9,10-DiHOME 均顯著降低。

由于注射奧沙利鉑24 h 后脂質(zhì)濃度產(chǎn)生差異，接下來研究了注射奧沙利鉑小鼠DRG 中相關(guān)脂質(zhì)氧化酶 (COX-2，LOX，CYPs) mRNA 的表達(dá)。但是，在注射奧沙利鉑后未觀察到脂質(zhì)氧化酶表達(dá)發(fā)生差異。同樣，分析了可溶性環(huán)氧化物水解酶2 (sEH) 的mRNA 表達(dá)水平，該酶可以將環(huán)氧化物降解為二醇。mRNA 表達(dá)分析顯示，在注射奧沙利鉑的小鼠DRG中，sEH 轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)無差異。與LC-QTOFMS 檢測結(jié)果一致，這些結(jié)果表明注射奧沙利鉑后的小鼠DRG 中9,10-EpOME 濃度升高的原因可能是底物亞油酸的豐度和可用性增加，而不是脂質(zhì)加氧酶的表達(dá)和活性增加。

（3）溶血磷脂酰膽堿和游離脂肪酸代謝產(chǎn)物與奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性疼痛有關(guān)：溶血磷脂酰膽堿 (LPCs)的亞組是在溶血磷脂家族中檢測到最豐富的脂質(zhì)。本文作者分析了LPC 亞組的19 種不同脂質(zhì)。結(jié)果顯示在注射奧沙利鉑后坐骨神經(jīng)和DRG中的LPC 18:1 顯著增加。在脊髓中，LPC 16:0 顯著增加。

此外，檢測了注射奧沙利鉑24 h 后DRG 中可以從復(fù)雜脂質(zhì)中釋放的LPC (iPLA2) 或游離脂肪酸(cPLA2) 的磷脂酶的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)兩種磷脂酶在注射奧沙利鉑24 h 后在DRG 中表達(dá)均增加。該結(jié)果與LC-QTOFMS 以及LC-MS/MS 的檢測結(jié)果一致，在注射奧沙利鉑24 h 后，脂質(zhì)家族游離脂肪酸和溶血磷脂酰膽堿的水平增加，并且9,10-EpOME濃度升高。另外，9,10-EpOME 濃度的升高驗(yàn)證了脂質(zhì)釋放酶mRNA 表達(dá)水平的升高增強(qiáng)了亞油酸釋放量和豐度增加的假設(shè)。

（4）LPC 16:0 和LPC 18:1 導(dǎo)致初級感覺神經(jīng)元的鈣瞬變：由于注射奧沙利鉑后坐骨神經(jīng)和DRGs 中的LPC 18:1 和脊髓中LPC 16:0 顯著增加，表明9,10-EpOME 對TRPV1 有敏化作用，使用Ca2+成像來分析LPC 16:0 和LPC 18:1 在感覺神經(jīng)元中的作用。用LPC 16:0 和LPC 18:1 短時(shí) (45 s) 刺激感覺神經(jīng)元，與對照組相比，可以觀察到所有測試濃度發(fā)生鈣瞬變圖。只有10 μM 的LPC 16:0 刺激能夠顯著增加響應(yīng)的感覺神經(jīng)元的數(shù)量。重復(fù)使用LPC 18:1 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測到大約6%的感覺神經(jīng)元在5 μM LPC 18:1 刺激后產(chǎn)生響應(yīng)。即使用1 μM和10 μM LPC 18:1 刺激后，感覺神經(jīng)元也顯示出反應(yīng)。但在這些測試濃度下與對照組相比無差異。以上結(jié)果顯示，LPC 16:0 和LPC 18:1 都可能引起感覺神經(jīng)元的瞬時(shí)Ca2+內(nèi)流。

接下來，本文作者開始確定對LPC 18:1 產(chǎn)生反應(yīng)的感覺神經(jīng)元亞群。用5 μM LPC 18:1 短時(shí)間 (45 s) 刺激神經(jīng)元后，用TRPA1 激動(dòng)劑AITC（異硫氰酸烯丙酯，100 μM; 40 s）和TRPV1 激動(dòng)劑辣椒素 (100 nM; 20 s) 共同刺激神經(jīng)元。如先前所示，在5 μM LPC 18:1 刺激后，對50 mM KCl 產(chǎn)生反應(yīng)的所有神經(jīng)元中，約7%出現(xiàn)瞬時(shí)Ca2+內(nèi)流。另外，共同刺激結(jié)果顯示在LPC 18:1 上發(fā)生反應(yīng)的神經(jīng)元也對選擇性TRPV1 激動(dòng)劑辣椒素產(chǎn)生明顯反應(yīng)。接下來用30 μM LPC 18:1 刺激轉(zhuǎn)染TRP 通道的HEK293 細(xì)胞60 s，與對照組相比，可以觀察到TRPV1 和TRPM8 陽性轉(zhuǎn)染的HEK293 細(xì)胞中瞬時(shí)Ca2+內(nèi)流顯著升高。在TRPA1 通道陽性轉(zhuǎn)染的HEK293 細(xì)胞中，與對照組和LPC 18:1 相比，Ca2+內(nèi)流未發(fā)生顯著變化。相反，與LPC 18:1 相比，對照組引起顯著的Ca2+內(nèi)流。TRP 通道陽性轉(zhuǎn)染的HEK293 細(xì)胞由特異性TRP 通道激動(dòng)劑反應(yīng)檢測。用TRP 通道轉(zhuǎn)染的HEK293 細(xì)胞進(jìn)行體外Ca2+成像分析證實(shí)了先前在原代感覺神經(jīng)元中的檢測結(jié)果，LPC 18:1 可以作為TRPV1 通道激活劑。另外，可以將TRPM8 通道作為可以由LPC 18:1 激活的第二個(gè)TRP 通道。

（5）LPC 18:1 在感覺神經(jīng)元中引起TRPV1 和TRPM8 依賴性鈣瞬變：為了進(jìn)一步確定LPC18:1的作用，本文作者將感覺神經(jīng)元與TRPA1 (HC 030031) 和TRPV1 (AMG 9810) 以及TRPM8 (AMTB鹽酸鹽) 的選擇性抑制劑一起孵育。研究發(fā)現(xiàn)用TRPA1 抑制劑孵育感覺神經(jīng)元時(shí)，用LPC 18:1 對Ca2+內(nèi)流沒有影響。但孵育TRPV1 和TRPM8 的抑制劑后由LPC 介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流顯著減少。以上結(jié)果顯示LPC 18:1 在通過激活TRPV1-和TRPM8 陽性神經(jīng)元的傷害性傳遞中起著重要作用。

為了驗(yàn)證LPC 18:1 是否可以有效激活TRPV1和TRPM8 通道，接下來，分別用特異性抑制劑分別抑制TRPV1 和TRPM8。首先用LPC 18:1 刺激感覺神經(jīng)元。然后，再次刺激前使用TRPV1 和TRPM8 抑制劑孵育神經(jīng)元。抑制TRPV1 或TRPM8可以部分阻斷由LPC 18:1 引起的Ca2+內(nèi)流。使用TRPV1 和 TRPM8 抑制劑后，可以響應(yīng)LPC 18:1 的神經(jīng)元數(shù)量降低約50%。這再次表明，LPC 18:1 可能會(huì)激活表達(dá)TRPV1 和TRPM8 神經(jīng)元亞群。為了檢測TRPV1 和TRPM8 是否受LPC 18:1 影響，接下來使用了兩種抑制劑的組合。抑制TRPV1 和TRPM8 后，由LPC 18:1 介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流可以被完全阻斷。此外，檢測了TRPV1 和TRPM8 缺陷型小鼠中LPC 誘導(dǎo)的鈣反應(yīng)。在TRPV1 缺陷型小鼠中，觀察到對LPC 18:1反應(yīng)的神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。在TRPM8 缺陷型小鼠中，發(fā)現(xiàn)了對LPC 18:1 反應(yīng)的神經(jīng)元數(shù)量也有減少的趨勢。

（6）LPC 18:1 在體內(nèi)引起機(jī)械性超敏反應(yīng)：為了探究LPC 18:1 在體內(nèi)是否有效，在野生型小鼠的左后足皮下分別注射了10 μM 和50 μM 的LPC 18:1和對照劑，并檢測了注射后0.5、1、2、3、4 和6 h小鼠的縮足反射潛伏期。檢測機(jī)械閾值后發(fā)現(xiàn)小鼠注射LPC 18:1 后0.5 h 出現(xiàn)機(jī)械超敏反應(yīng)，并可以持續(xù)2 h。

3. 討論

本研究觀察到注射奧沙利鉑后神經(jīng)組織中各種脂質(zhì)的合成發(fā)生了顯著變化。LC-MS/MS 檢測結(jié)果顯示DRG 中前列腺素濃度顯著降低，而9,10-EpOME濃度升高。后者已被Sisignano 等證明可以引發(fā)感覺神經(jīng)元的TRPV1 通道敏化并在體內(nèi)引起機(jī)械和熱超敏反應(yīng)。此外，非靶向性脂質(zhì)組學(xué)分析顯示在注射奧沙利鉑小鼠的DRGs 和坐骨神經(jīng)中，溶血磷脂酰膽堿信號增強(qiáng)，特別是LPC 18:1。通過對LPC 18:1 的研究，觀察到在TRPV1 和TRPM8 陽性感覺神經(jīng)元中，脂質(zhì)可以引起Ca2+的瞬變。

在本研究中未觀察到脊髓背角趨化因子、生長因子和細(xì)胞因子水平以及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化程度的變化，這表明經(jīng)典的炎癥過程和相關(guān)介質(zhì)似乎對奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性疼痛影響不大。用qPCR 分析檢測到注射奧沙利鉑的小鼠DRG 中ROS 產(chǎn)生酶的mRNA 表達(dá)未發(fā)生顯著增加。Doyle 等研究中發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活以及促炎性細(xì)胞因子和ROS 水平升高可能會(huì)促進(jìn)CINP。但主要研究了CIPN 的后續(xù)時(shí)間點(diǎn)（注射后的幾天或幾周）。本研究結(jié)果表明，經(jīng)典炎癥通路和相關(guān)介質(zhì)在奧沙利鉑誘發(fā)的疼痛中的作用不像在其他慢性疼痛中那么重要，因此可能是在奧沙利鉑誘發(fā)神經(jīng)性病變后期開始的繼發(fā)性反應(yīng)。此外，盡管可以觀察到雌雄小鼠之間脂質(zhì)濃度的差異，但奧沙利鉑誘發(fā)的機(jī)械性超敏反應(yīng)的程度在雌雄小鼠中相似，表明這些濃度差異對不同性別的奧沙利鉑誘發(fā)的機(jī)械性超敏反應(yīng)沒有直接影響。

非靶向性脂質(zhì)組學(xué)檢測顯示注射奧沙利鉑后的小鼠坐骨神經(jīng)和DRG 中的LPC 18:1 以及脊髓中的LPC 16:0 顯著升高。據(jù)Abeele 等的研究報(bào)道，不同的LPC 種類可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)染后的HEK-293 細(xì)胞中TRPM8 通道的開放概率。Andersson 等在TRPM8轉(zhuǎn)染的CHO 細(xì)胞中用LPC 16:0 處理后觀察到相同的效果。本研究的結(jié)果與這兩項(xiàng)研究一致，但在此基礎(chǔ)增加了重要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即LPC 18:1 和LPC 16:0對DRG 神經(jīng)元的TRPM8 和TRPV1 通道均起作用。而Nieto-Posadas 和Canul-Sánchez 等與本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，通過內(nèi)面向外式膜片鉗和單通道電流無法檢測到由LPC 引起的HEK-293 細(xì)胞中的TRPV1激活，這表明在異源表達(dá)系統(tǒng)中觀察到的鈣瞬變是由LPC 18:1 間接激活TRPV1 引起的。

在體數(shù)據(jù)顯示LPC 18:1 可引起機(jī)械性超敏反應(yīng)。因此，坐骨神經(jīng)和DRGs 中LPC 18:1 水平升高可能直接導(dǎo)致奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性周圍性疼痛。并且發(fā)現(xiàn)在注射奧沙利鉑24 h 后的小鼠DRG 中亞油酸衍生的代謝物9,10-EpOME 顯著增加。Sisignano等的研究表明，由CYP2J6 合成的9,10-EpOME 不僅對TRPV1 通道具有直接的致敏作用，而且還可以在體內(nèi)引起機(jī)械性超敏反應(yīng)和熱痛。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LPC 和游離脂肪酸水平顯著增加，同樣本文作者也證明了cPLA2-和iPLA2-途徑在奧沙利鉑治療動(dòng)物的DRGs 中可能被激活。Dennis 等證明磷脂酶可以從膜磷脂中釋放游離脂肪酸 (cPLA2) 和溶血磷脂 (iPLA2)。一項(xiàng)針對于iPLA2 途徑的研究顯示，由冷和TRPM8 激動(dòng)劑icilin 激活的TRPM8 可被選擇性iPLA2 抑制劑溴烯醇內(nèi)酯 (BEL) 所阻斷。而用BEL處理的在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明由LPC 16:0 引起的冷痛敏不能被iPLA2 的抑制劑所阻斷。并且iPLA2 參與了前列腺素的生產(chǎn)過程，通過BEL 抑制iPLA2可以導(dǎo)致前列腺素濃度降低。本研究表明了靶向iPLA2 途徑并通過抑制CYP2J6 減少9,10-EpOME合成可減輕奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性疼痛。但目前尚沒有可以用作臨床候選藥物的選擇性iPLA2 拮抗劑，需要進(jìn)行更多研究來探索iPLA2 的潛在生理作用，這可能給治療的病人帶來不良反應(yīng)。

除脂質(zhì)信號傳導(dǎo)途徑外，本研究結(jié)果表明靶向TRP 通道可能有利于阻斷奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性周圍性疼痛。Chukyo 等研究表明，在奧沙利鉑治療后，DRG 中TRPM8 和TRPV1 轉(zhuǎn)錄本在后續(xù)時(shí)間點(diǎn)增加，并可能導(dǎo)致冷痛敏。此外，Wong＆Gavva 等報(bào)道稱辣椒堿通過抑制TRPV1-和TRPM8 通道降低奧沙利鉑誘導(dǎo)的體內(nèi)冷性異常性疼痛，而不僅僅是5′-碘樹脂毒素抑制TRPV1-通道。但目前尚無可用于臨床的TRP 通道拮抗劑。先前的TRPV1 拮抗劑早期臨床試驗(yàn)由于導(dǎo)致病人體溫過高而失敗，這表明TRPV1 在維持體溫方面起著重要作用，并阻礙了安全的TRPV1 拮抗劑的臨床開發(fā)。

綜上所述，本研究突出了奧沙利鉑治療后神經(jīng)元脂質(zhì)合成和代謝早期變化的重要性，并確定了LPC-EpOME-TRPV1-TRPM8 信號通路脂質(zhì)在奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性疼痛中的關(guān)鍵作用。