分子生物學技術在生物戰病原微生物檢測中的應用*

劉 瑋 綜述，路 穎，于慶潭△ 審校

1.海軍青島特勤療養中心檢驗科，山東青島 266071；2.中國人民解放軍海軍第971醫院檢驗科，山東青島 266071

生物戰是指在戰爭場景中故意使用生物制劑(如細菌、病毒、立克次體、衣原體、真菌和毒素)作為武器，生物戰病原微生物可能比其他常規武器系統更致命，很小的數量也可能造成大規模傷亡[1]。生物武器是指裝有生物戰病原微生物及傳播媒介的各種施放裝置的總稱，最初的生物戰病原微生物多為細菌，隨著科技的進步，生物戰病原微生物發展為多種病原微生物及毒素。生物戰以其較低的經濟成本、大規模的效應面積、難以預估的心理負面效應，很有可能成為未來戰爭的主要方式。從2003年嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒及2012年中東呼吸綜合征冠狀病毒的暴發可以明顯看出，傳染病病原體的敏感、特異和快速診斷對于確定陽性病例、追蹤其接觸者、發現病毒來源及最終使控制感染的措施合理化至關重要[2]?；仡櫸覈箵粜滦凸跔畈《痉窝?COVID-19)阻擊戰的經驗教訓，及早確診和隔離是制勝的關鍵，更是充分說明了病原微生物的早期檢測和鑒定對于打贏生物戰的重要性。2020年新型冠狀病毒的全基因組測序使科學家們在短期內就設計出了檢測方案來檢測受感染人群中的病原體，并且為病毒的系統發育研究提供了參考，使研究者對病毒的傳播途徑有了快速、準確的判斷[3-4]。隨著全球生物安全態勢的不斷變化，如果未來生物戰中使用類似病原微生物來作為武器將造成非常嚴重的后果。

1 分子生物學技術在生物戰病原微生物檢測中的技術優勢

傳統微生物檢測方法費時、費力，無法滿足快速檢測的需求，隨著以基因診斷為基礎的各種分子生物學技術的發展，現代分子生物學對微生物的認識，從對微生物外部結構、生物特性的研究和分析繼而轉向對微生物內部基因的探究?，F代分子生物學通過利用核酸探針技術、聚合酶鏈反應(PCR)、基因芯片技術、下一代測序技術等在遺傳物質DNA和RNA分子水平對微生物進行檢測，已經成為一種重要的微生物檢測方法[5]。如果在未來的生物戰過程中應用現代分子生物學技術進行檢驗檢疫，將極大地縮短檢驗時間，并能明顯提高檢驗精度。

2 分子生物學技術在生物戰病原微生物檢測中的應用

2.1核酸探針技術 隨著分子生物學和基因工程技術的不斷進步,發展出了靈敏度高、特異性好、方便快捷的核酸探針技術。核酸探針技術也稱為基因診斷技術，該技術是利用微生物基因中DNA或RNA的堿基互補原理，利用生物標記的特異核苷酸序列的單鏈 DNA或RNA片段作為探針,通過核酸雜交技術對病原微生物核酸、蛋白質分子進行快速檢測，從而達到快速鑒定相關病原微生物的目的[6]。目前常用的探針雜交方法主要有:DNA印跡雜交、RNA印跡雜交和蛋白質印跡雜交，用于檢測標本中的DNA、RNA或相關蛋白質分子的基因，從而對感染性病原體進行檢測[7]。核酸雜交技術可一次性對多種基因的多個位點進行快速基因型鑒定，具有檢測信息量大的特點，在未來生物戰病原微生物檢測中應用前景極大。

2.2PCR PCR是在聚合酶的催化下由特定引物(寡核苷酸)介導的特異性基因片段體外酶促的擴增技術。在過去一個世紀里，很少有發明能與PCR的重要性相提并論，因為它徹底改變了生物和遺傳研究。PCR作為傳染病診斷工具的有用性在1987年的檢測中得到證明，并在后來臨床上被廣泛應用于檢測病毒和細菌感染的微生物學領域[8]。

反轉錄-PCR(RT-PCR)是一種高度特異和敏感的傳染病檢測診斷方法，由于這種方法是基于核酸的檢測，在抗擊COVID-19阻擊戰中發揮了重要作用，它能夠通過檢測患者標本中的新型冠狀病毒核糖核酸來早期診斷COVID-19[9]。目前，COVID-19的確診主要依靠新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒熒光定量PCR,該試劑盒采用多重PCR與RT-PCR相結合的方法,對新型冠狀病毒感染疑似病例的鼻咽拭子、口咽拭子及痰液標本中新型冠狀病毒的相關基因進行檢測[10]。隨著疫情的發展，發現一種簡單方便的收集患者標本的方法取代痛苦的鼻咽拭子收集過程，降低衛生從業人員在標本收集過程中感染的風險，是臨床一線醫務人員的迫切需要。在這種情況下，羅格斯臨床基因組實驗室提出了開發一個基于RT-PCR的想法，他們開發了一種檢測試劑盒，該試劑盒可以檢測唾液中新型冠狀病毒的核糖核酸[11]。

針對生物戰中多樣化的生物戰病原微生物，現代分子生物學PCR能夠滿足各種病原微生物的快速檢測需求。

2.3基因芯片技術 基因芯片技術又稱為DNA微陣列或DNA芯片,它是在基因探針的基礎上研制出來的,根據堿基互補的原理,利用基因探針到基因混合物中識別特定基因。利用顯微點樣或原位合成技術，將大量 DNA探針按照指定順序和密度固定在載體(如硝酸纖維素膜、尼龍膜、塑料片等)的表面，然后與熒光染料或生物素標記的核酸分子進行雜交，并分析獲取標記物的熒光或生物信號，從而獲得待測樣品中相關基因的表達信息[12]。

目前，基因芯片技術分為傳統芯片和可視化芯片兩大類。傳統基因芯片具有高通量、同步檢測大量樣品，核素、熒光或生物素標記的放大效應及減少外界因素干擾等優點；可視化基因芯片靈敏度高、操作簡單，能夠更明顯地提高病原微生物的檢測速度和效率[13]?；蛐酒夹g在生物戰病原微生物檢測中能快速高通量檢測病原微生物的核酸，在病原微生物基因診斷研究中意義重大。

2.4微流體技術 以RNA為遺傳核心物質的病毒可導致埃博拉、丙型肝炎、流行性感冒、嚴重急性呼吸綜合征和脊髓灰質炎等疾病。冠狀病毒是包膜的單鏈RNA病毒，可導致人類和動物疾病，曾導致了3次流行病大暴發:2002-2003年的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒，2012年的中東呼吸綜合征冠狀病毒，以及2019年的新型冠狀病毒[14]。由于RNA病毒的高效傳染性，未來不排除以RNA病毒作為生物戰病原微生物進行大規模生物戰的可能。

采用快速定量PCR檢測RNA病毒是常規做法，RT-PCR由于其具備靈敏度高、特異性好和通量高的特點，現已成為大流行暴發時主要的病毒檢測技術,但其需要配套的生物安全實驗室作為技術平臺，無法實現便攜、可移動及現場快速檢測的要求[15]。一種更快速、易于使用和廉價的診斷方法——微流體技術，能夠在30 min內完成檢測，有望成為未來RNA病毒類病原體檢測的新方法。

微流體技術以前曾用于檢測甲型流感病毒H1N1、寨卡病毒、甲型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒和諾如病毒等核糖核酸病毒，結果令人滿意。據報道，在集成有可控微磁場的微流控芯片上進行核酸雜交是一種同時檢測和分型多種流感病毒的快速方法，甲型流感病毒H1N1、H3N2和H9N2亞型可在80 min內同時檢測，檢測限分別約為0.21、0.16和0.12 nm[16]。因此，微流體技術可以成為一個可靠的技術平臺，具有快速診斷和分型病毒的能力。病毒抗體檢測常用的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)通常需要幾個小時才能完成，但將這種方法與微流體系統相結合，可以實現高效快速的診斷。有研究使用ELISA微流控系統在60 min內完成亨德拉病毒IgG抗體檢測；在另一項研究中，在基于ELISA的微流控平臺的幫助下，檢測禽流感病毒僅需1.5 h；基于夾心免疫測定的微流體裝置也被應用于流行性感冒的快速檢測[17-19]。目前，主要應用的有基于紙張和基于渠道的兩種不同的微流體裝置：紙張工具由一系列親水性纖維素或硝化纖維制成，通過吸收引導紙張中的液體；基于渠道的微流體裝置可以使用4種主要方法來制造，包括層壓、模制、3D打印和納米制造[20]。

微流體系統為許多診斷測試提供了一個平臺，包括RT-PCR、巢式PCR、核酸雜交、ELISA等，有望成為更快、更便宜、更易于使用、靈敏度更高的檢測方法。因此,微流體設備很有可能成為傳統檢測病毒RNA的替代方法，在未來生物戰RNA類病毒病原體檢測中，微流體系統將發揮巨大作用。

2.5下一代測序技術 過去20年高通量DNA測序方法發展迅速，新方法不斷商業化，以較低成本對大基因組進行高通量測序的需求引發了下一代測序技術，下一代測序技術是一種允許數百萬個DNA或RNA序列同時測序的技術[21]。與傳統測序法比較，下一代測序技術的優勢包括樣品復用的更高吞吐量、檢測低頻變異的更高靈敏度、高樣品量的更快周轉時間和更低的成本。

下一代測序技術也稱為大規模并行測序或高通量測序，“下一代”一詞意味著DNA測序技術的下一步發展，主要包括第2代和第3代測序方法[22]。第2代測序方法可分為兩大類，即雜交測序法和合成測序法，第2代測序反應通常在小室中的納米體、微粒體上并行運行，因此，每對基因測序的成本比較低廉，同時技術的不斷改進和檢測儀器的小型化正在進一步降低其成本。第3代測序以單分子測序和納米孔測序為主，不需要進行核酸擴增，讀長明顯優于第2代測序，與第2代測序方法相比，第3代測序方法旨在對長DNA和RNA分子進行測序[23]。

下一代測序技術相對于經典Sanger測序的主要優勢是:(1)高通量能力，可以并行完成數億個測序反應，使整個細菌基因組的完全測序只需一兩次儀器運行；(2)單一方案可適合于所有微生物的鑒定和基因分型；(3)在無細胞系統中，完全依賴于文庫的制備，消除了DNA克??；(4)不需要關于特定基因/基因組序列的先驗知識，因為高溫超導可以讀取隨機分布在整個基因組中的DNA模板，然后可以應用從頭基因組組裝；(5)不需要分離和培養感興趣的微生物，這是一個特別關鍵的方面，因為許多菌株不能在培養基中生長，這使能夠鑒定以微量存在的微生物及那些以前用常規方法未檢測到的微生物；(6)成本和周轉時間減少。下一代測序技術的主要缺點與數據存儲需要電腦內存空間大、生物信息學分析技術復雜、需要專門學?；蛴蓪I人士進行有關[24]。

生物戰病原微生物可以包括許多常見和不常見的病原體，從病毒到細菌、真菌和寄生蟲，假設使用常規的分子檢測，如PCR可以針對許多特定目標生物的單獨檢測，但可能遺漏罕見的病原體或使用與所涉及的病原體不匹配的引物，因而降低了檢測的靈敏度和檢出效率[25]。而下一代測序技術不僅可以高通量對多種可能的病原微生物進行檢測，同時還可以通過對測序讀數的計數提供關于樣品中生物體水平的定量或半定量數據，這對于生物戰病原微生物種類的確定非常有幫助。同時，隨著DNA測序技術的進步，未來將更快、更準確地進行測序，測序平臺較小、需要較少的動力、較少的試劑和維護，有利于將測序技術應用于未知生物的檢測和生物戰病原微生物的研究工作中。

3 各種分子生物學技術對比分析

生物戰病原微生物普遍具有高傳染性,能形成突發大規模疫情,對比2020年10月17日通過、自2021年4月15日起施行的《中華人民共和國生物安全法》，生物安全已經不僅僅局限于生物戰等特殊戰場，更是上升到了國家安全的層面。因此，對于未來可能出現的威脅國家安全和戰場勝利的生物戰病原微生物早期、快速、準確的檢測顯得尤為重要。下面將對上述分子診斷技術——核酸探針技術、PCR、微流體技術、基因芯片技術及下一代測序技術在生物戰病原微生物檢測中應用的優缺點進行總結和比較：核酸探針技術具有可一次性對多種基因的多個位點進行快速基因型鑒定，具有特異性強、檢測速度快、檢測信息量大的特點；核酸探針技術檢測時存在耗時長、成本高、操作煩瑣、工作量大等缺點，限制了其在生物戰病原微生物檢測中的應用，目前核酸探針技術主要被廣泛應用于產前診斷過程中。

PCR不僅具有較高的靈敏度和特異度，還能區分病原微生物的類型和亞型，適合于多種類型的病原微生物；其缺點在于僅適合于已知的病原微生物，對于新發和未知的病原微生物沒有辦法設計相應的引物，一般在基因測序技術明確了生物戰病原微生物的種類和基因序列之后，可以作為大規模篩查的工具。

基因芯片技術在生物戰病原微生物檢測中的應用優勢在于能夠快速高通量檢測病原微生物的核酸，并且操作簡單、自動化程度高；其缺點在于目前制作基因芯片成本高、價格昂貴、對操作人員的技術要求較高，并且具有重復性差的缺點，使其應用范圍受到很大的限制。由于基因芯片技術的上述優點和缺點，在未來生物戰病原微生物檢測中，基因芯片不能作為常規檢測方法，但是可作為科研的研究手段對生物戰病原微生物的生物性狀、基因特點進行深入分析。

微流體技術以其小型化、便攜式裝置非常適合在生物戰病原微生物檢測中發揮作用，因為這些自動化的、精確的和成本有效的微流體技術診斷設備不需要受過專業訓練的醫療專家，并且可以由一般軍隊醫療人員在現場使用；但微流體技術目前主要應用于病毒的檢測方面，應用范圍比較窄，并且其對專業技術的要求比較高，需要醫務人員和工程師的全力配合。因此，微流體技術以其快速、簡便、高效的檢測能力，在未來生物戰病原微生物的檢測過程中可以選擇性應用于病毒檢測方面。

下一代測序技術在新發病原體檢測方面的優勢是可以快速、經濟、精確、高通量對多種可能的病原微生物進行檢測，并對新發的病原微生物進行鑒定，為臨床篩查、診治贏得了寶貴時間；下一代測序技術的缺點是檢測樣品中存在的微生物污染物、用于處理的試劑殘留或實驗室環境的影響，這可能使結果的分析和解釋變得復雜。在臨床標本的常規采集過程中，即使對身體中可能無菌的部位進行活組織檢查也會被無意污染，包括采樣過程中皮膚菌群的污染或口腔菌群的污染[26]。因此，需要嚴格遵守試劑和工作流程的質量控制程序，以保持盡可能無菌和無核酸的測試環境，使用陰性質控品、試劑評估和定期刷檢來確保實驗室和樣品交叉污染不會產生假陽性結果。

目前，國內外均在積極研制簡便、實用、可攜帶的便攜式生物戰病原微生物檢測箱，主要集中在實用新型發明專利中，但其核心還是檢測技術的更新，如何將更快、更便捷、更準確、更經濟的檢測技術應用于生物戰病原微生物的檢測是未來的研究方向。隨著現代分子生物學診斷技術的發展，技術不斷成熟，核酸探針技術、PCR、微流體技術、基因芯片技術及下一代測序技術等分子生物學技術已經在臨床診治中得到廣泛應用，如果能夠正確將各種不同的分子生物學技術加以合理應用，分子生物學技術將在未來生物戰病原微生物的檢測檢疫中發揮十分重要的作用。