基于Wnt/β-catenin信號通路的中藥單體治療結直腸癌的作用機制研究進展

徐曉華，吳煜

(中國中醫科學院西苑醫院腫瘤科，北京 100091)

結直腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤。國際癌癥研究機構的GLOBOCAN數據顯示，2020年預計全球腫瘤新發病例約1 930萬例，死亡病例約1 000萬例，其中結直腸癌占所有新發病例的10.0%，僅次于乳腺癌和肺癌，占所有死亡病例的9.4%，僅次于肺癌[1]。據國家癌癥中心數據顯示，2015年我國結直腸癌新發病例38.8萬例，死亡病例18.7萬例，其發病率和死亡率分別居惡性腫瘤的第3位和第5位[2]。目前，對于結直腸癌的治療，除了手術、化療、放療、靶向治療、免疫治療外，中醫藥治療也是重要的治療方式之一，其臨床應用廣泛，既對癌前病變和復發轉移具有一定的預防作用，又能協同化療，提高化療完成率，減輕化療不良反應，同時在腫瘤患者身體、心理、功能等方面的康復治療中也發揮核心作用[3]，但中藥化學成分復雜，作用機制多樣，缺乏一定的精準性。

與傳統中草藥相比，中藥單體化學成分單一，用藥劑量小，作用機制明確，在基礎研究和新藥研發中具有一定優勢。隨著醫學研究的深入，越來越多的中藥單體被發現對結直腸癌具有明確的作用，如白藜蘆醇[4]、粉防己堿[5]、姜黃素[6]等。Wnt/β聯蛋白(β-catenin)信號通路是腫瘤經典的信號通路，Wnt家族通過轉錄輔激活因子β-catenin的信號通路調控胚胎發育和成人穩態，并與先天畸形、癌癥、骨質疏松等疾病相關[7]。根據是否存在β-catenin依賴性，Wnt信號通路可分為經典和非經典信號通路[8]，在已知的Wnt信號級聯反應中，約90%的結直腸癌Wnt/β-catenin信號通路(經典Wnt信號通路)發生突變[9]。現就基于Wnt/β-catenin信號通路的中藥單體治療結直腸癌的作用機制研究進展予以綜述，以期為中藥單體在結直腸癌的研究和應用提供參考。

1 Wnt/β-catenin信號通路

Wnt蛋白是富含半胱氨酸的分泌糖蛋白，分子量約為40 000，可以調節Wnt/β-catenin信號通路核心介質β-catenin的轉錄活性，是穩定β-catenin的關鍵細胞外調節因子[10]。正常情況下，軸抑制蛋白(axis inhibition protein，AXIN)、結腸腺瘤性息肉病(adenomatous polyposis coli，APC)蛋白、酪蛋白激酶1α和糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)形成的破壞復合物(AXIN復合物)可以介導β-catenin磷酸化，進而被蛋白酶體26S降解，而Wnt糖蛋白配體與Fzd(Frizzled)受體和低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6)形成的Wnt-Fzd-LRP5/6復合物可以將蓬亂蛋白轉移到質膜，募集破壞復合物與受體結合進而介導LRP5/6磷酸化，該過程抑制了β-catenin磷酸化，導致β-catenin發生胞質積累和核轉運，β-catenin在細胞核中取代輔阻遏物Groucho，與T細胞因子(T cell factor，TCF)/淋巴增強因子(lymphoid enhancer factor，LEF)結合從而激活Wnt依賴的基因表達[11]。

2 中藥單體抗結直腸癌的作用機制

2.1抑制腫瘤細胞增殖 白藜蘆醇是來源于葡萄、虎杖、桑葚等植物的多酚類物質。王靜宇等[4]用100 ng/mL的白藜蘆醇處理結腸癌HCT116細胞48 h，結果顯示細胞增殖被明顯抑制，其機制可能與抑制β-catenin及Wnt/β-catenin信號通路靶基因c-Myc和細胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表達有關。袁霜雪等[12]發現，采用不同劑量(20、40、60、80、100 μmol/L)的白藜蘆醇干預結腸癌HCT116細胞可以劑量依賴性地抑制其增殖；進一步分析顯示，白藜蘆醇可以抑制TCF4/LEF報告質粒的轉錄活性，減少β-catenin蛋白和信使RNA(messenger RNA，mRNA)的表達。劉映孜[13]發現白藜蘆醇可以抑制結腸癌HCT116細胞增殖，使細胞阻滯在G1期，其機制可能與白藜蘆醇降低磷酸化GSK-3β蛋白水平、β-catenin mRNA表達水平和β-catenin/TCF4轉錄活性，抑制Wnt/β-catenin信號轉導有關；此外，白藜蘆醇也可促進細胞凋亡。

人參皂苷Rg3是從五加科植物人參中提取的一種四環三萜皂苷類物質，在紅參中含量豐富，也可由人參皂苷Rb1、Rb2和Rd在一定條件下轉化而成[14]。車章洪和何百成[15]分別用40、60、100、150 μmol/L的人參皂苷Rg3作用于結腸癌HCT116細胞72 h，發現藥物濃度在60 μmol/L時，細胞增殖被明顯抑制，且藥物濃度越高，抑制作用越強；熒光素酶報告質粒檢測和免疫熒光結果顯示，人參皂苷Rg3可能通過阻止β-catenin的核轉移而抑制β-catenin/TCF4轉錄活性和下游c-Myc蛋白的表達。何運元等[16]發現，人參皂苷Rg3可以抑制結腸癌HCT116和SW480細胞的增殖，誘導細胞凋亡，降低β-catenin磷酸化程度及減少β-catenin、c-Myc蛋白的表達，表明人參皂苷Rg3通過調控Wnt/β-catenin信號通路發揮作用。

雷公藤紅素和雷公藤甲素是來自衛矛科植物雷公藤的三萜類化合物和環氧二萜內酯類化合物，兩者均可抑制結直腸癌細胞生長。王術人[17]發現，雷公藤紅素對結腸癌HCT116和SW480細胞生長的抑制具有時間和劑量依賴性，同時還可抑制腫瘤細胞克隆形成，促進細胞凋亡，且在C57BL/6J-ApcMin/+小鼠和氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉小鼠兩種結腸癌動物模型中具有同樣的效果；機制研究顯示，雷公藤紅素通過增強熱激因子1的表達上調肝激酶B1的轉錄活性，肝激酶B1激活下游分子AMP活化蛋白激酶α，使Yes相關蛋白發生磷酸化，磷酸化的Yes相關蛋白進一步促進泛素化-蛋白酶體途徑對β-catenin的降解，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路。劉娟娟[18]發現，雷公藤甲素可以使結腸癌HT29和SW480細胞發生G1期阻滯，抑制細胞增殖，且具有劑量和時間依賴性，其機制與雷公藤甲素抑制Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin進入細胞核，減少下游靶基因LEF/TCF表達，抑制細胞轉錄和翻譯有關。

粉防己堿又稱粉防己甲素，是提取自防己科植物粉防己的一種二芐基異喹啉類生物堿。王東旭等[5]和吳柯[19]發現，粉防己堿可以誘導結腸癌LoVo細胞發生G1期阻滯，抑制細胞增殖，并通過過表達和沉默表達胰島素樣生長因子結合蛋白5驗證了粉防己堿對結腸癌LoVo細胞的抑制與胰島素樣生長因子結合蛋白5的下調有關；深入研究表明，粉防己堿可能通過促進p53表達負性調控胰島素樣生長因子結合蛋白5的表達，進而干擾β-catenin/TCF轉錄活性和c-Myc的表達，抑制Wnt/β-catenin信號通路。劉映孜等[20]發現，粉防己堿可以抑制結腸癌HCT116細胞增殖，其機制可能與粉防己堿抑制Wnt/β-catenin信號通路中LEF/TCF4和c-Myc/Max轉錄活性及β-catenin蛋白的表達有關。此外，粉防己堿還可誘導結腸癌細胞凋亡。

姜黃素是從姜科植物姜黃中提取的一種多酚化合物。Jiang等[6]發現，姜黃素可以劑量依賴性地抑制結腸癌SW620細胞的增殖，促進細胞凋亡，并通過沉默表達尾型同源盒轉錄因子2，驗證了姜黃素通過上調尾型同源盒轉錄因子2的表達而抑制β-catenin的核轉運及Wnt3a和Wnt下游信號轉導基因[c-Myc、生存素(survivin)、cyclinD1]的表達。劉英等[21]證實，姜黃素可以通過降低磷酸化β-catenin和Wnt3a的蛋白水平抑制Wnt/β-catenin信號通路中cyclinD1、survivin、c-Myc的表達，使結腸癌HT29細胞發生G0/G1期阻滯，從而抑制細胞增殖。

Falcarindiol為五加科刺人參屬植物東北刺人參中的高含量炔醇化合物，其可以通過抑制Wnt/β-catenin通路中β-catenin、cyclinD1和c-Myc的表達，將結腸癌HCT116細胞阻滯在G2/M期而抑制其細胞增殖[22]。另有研究顯示，馬錢子中分離出來的馬錢子堿亦可以通過上述途徑抑制結腸癌SW480細胞的增殖[23]。

熊果酸是存在于人參、夏枯草、冬凌草等多種植物中的五環三萜類化合物，也可見于水果和蔬菜中[24]。邵英等[25]發現，熊果酸可以呈劑量和時間依賴性地抑制結腸癌HCT116細胞的增殖，誘導細胞發生G1期阻滯和細胞凋亡，并進一步通過過表達轉化生長因子-β3(transforming growth factor-β3，TGF-β3)和特異性抑制TGF-β3證實了熊果酸是通過下調TGF-β3表達，降低Wnt/β-catenin轉錄活性來發揮作用。

吳茱萸堿是源自蕓香科植物吳茱萸的一種生物堿。王元惠和周振華[26]研究發現，吳茱萸堿可以劑量依賴性地抑制結腸癌HT29細胞的增殖，將細胞阻滯在G0/G1期，其機制與吳茱萸堿減少Wnt和β-catenin mRNA的表達，進而抑制Wnt/β-catenin下游血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(VEGFA、VEGFB、VEGFC)和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)(MMP-3、MMP-14)的表達有關。

和厚樸酚是木蘭科植物厚樸中的一種新木脂素類化合物。吳柯等[27]用不同劑量(10、12.5、15、17.5、20 μmol/L)的和厚樸酚作用于結腸癌LoVo細胞，發現隨著藥物劑量的升高，細胞增殖率明顯下降，同時和厚樸酚可以增強胱天蛋白酶(caspase)3蛋白的表達，促進細胞凋亡，且進一步研究發現和厚樸酚是通過抑制β-catenin/TCF4轉錄活性發揮作用。

漢黃芩素是從黃芩、半枝蓮等植物中提取的一種黃酮類化合物。李彥萍等[28]研究表明，漢黃芩素對結腸癌SW480細胞增殖的抑制具有劑量依賴性，可將細胞阻滯在G1期，借助網絡藥理學發現其機制與漢黃芩素調控Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白β-catenin、survivin、GSK-3β和Bcl-2相關X蛋白的表達有關。

此外，二氫丹參酮[29]、青蒿琥酯[30]、冬凌草甲素[31]、小檗堿[32]均可以通過下調β-catenin和(或)c-Myc的表達抑制Wnt/β-catenin信號轉導來抑制結腸癌細胞的增殖。

2.2誘導腫瘤細胞凋亡 異補骨脂查爾酮是從豆科植物補骨脂中分離出的一種類黃酮類物質。Li等[33]發現，異補骨脂查爾酮可以通過調節凋亡相關蛋白(上調活化的caspase-3 、活化的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶，下調Bcl-2/Bcl-2相關X蛋白、X連鎖凋亡抑制蛋白、survivin)的表達誘導結腸癌HCT116和SW480細胞細胞核形態改變，發生細胞凋亡，進而抑制細胞生長；進一步研究表明，異補骨脂查爾酮是通過抑制蛋白激酶B/GSK-3β信號轉導促進β-catenin降解，從而調控Wnt/β-catenin信號通路。

重樓皂苷Ⅶ是從百合科植物重樓中提取出的甾體皂苷類成分。陳鳴旺等[34]對結直腸癌小鼠腹腔注射重樓皂苷Ⅶ，通過對腫瘤組織進行病理學檢查發現，重樓皂苷Ⅶ可以通過上調凋亡相關蛋白(活化的caspase-3、caspase-8、caspase-9和Bcl-2相關X蛋白)表達，下調Bcl-2表達來誘導腫瘤細胞凋亡；此外，重樓皂苷Ⅶ還可以干預細胞周期相關蛋白的表達，并抑制Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin蛋白和八聚體結合轉錄因子4、性別決定區Y框蛋白2、c-Myc、TCF4基因的表達。

藤黃酸是藤黃科植物藤黃的主要活性成分。戴維等[35]采用不同劑量(0、1.5、3、6 mg/L)的藤黃酸干預結直腸癌Caco2細胞發現，細胞凋亡率隨藥物劑量的增加而升高，且細胞中活化的caspase-3、活化的caspase-9、Beclin 1、微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ/微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅰ水平升高，β-catenin、c-Myc水平降低，Wnt/β-catenin激活劑氯化鋰可以逆轉上述作用，表明藤黃酸是通過Wnt/β-catenin信號通路誘導細胞凋亡。

青蒿琥酯是菊科植物青蒿中青蒿素的一種衍生物。郭穎等[36]發現，青蒿琥酯可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路中TCF4/LEF的轉錄活性，上調GSK-3β，下調β-catenin和c-Myc的表達促進結腸癌LoVo細胞早期凋亡。

2.3抑制腫瘤細胞遷移和侵襲 菝葜皂苷是一種來源于中藥知母中的皂苷元[37]。孫書凱等[38]分別用低、中、高劑量菝葜皂苷處理結腸癌HCT116和HT29細胞，并用劃痕實驗和Transwell小室法觀察其對細胞遷移和侵襲的影響，結果顯示菝葜皂苷干預后兩種細胞的相對遷移距離減小，侵襲細胞個數降低，且具有劑量依賴性，同時細胞中β-catenin、c-Myc和TCF4蛋白的相對表達量降低，上皮鈣黏素蛋白的相對表達量升高，表明菝葜皂苷通過抑制Wnt/β-catenin信號通路發揮抗遷移和侵襲的作用；此外，菝葜皂苷還可通過此途徑抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。

木犀草素是存在于金銀花、馬齒莧、紫蘇等多種植物和辣椒、胡蘿卜、油橄欖等蔬果中的一種天然黃酮類化合物[39]。陳志成等[40]用10、20、40 μmol/L的木犀草素作用于LoVo細胞來源的結直腸癌干細胞樣細胞，發現20和40 μmol/L的木犀草素可以明顯抑制細胞侵襲轉移，且具有劑量依賴性；進一步對Wnt/β-catenin/TCF4信號通路相關蛋白進行免疫印跡檢測發現，木犀草素可以增強上皮鈣黏素表達，抑制Twist、β-catenin、TCF4和MMP-2的表達。

芹菜素是存在于芹菜、葡萄、蘋果等蔬果中的一種黃酮類化合物。張竹易[41]用30 μmol/L的芹菜素干預結腸癌SW480細胞24 h，發現其可以減少穿膜細胞，抑制40%的細胞發生遷移，對細胞侵襲的有效率達65%；進一步研究表明，芹菜素可以降低β-catenin mRNA和蛋白水平，促進β-catenin磷酸化，抑制β-catenin核轉位，進而減少Wnt/β-catenin下游轉移相關蛋白環加氧酶2、人類細絲蛋白形成增強子1、MMP-2的表達，并通過SW480異體移植瘤和肺轉移瘤裸鼠驗證了芹菜素抑制腫瘤生長和轉移的作用。

此外，Ji等[42]研究發現白藜蘆醇可以劑量依賴性地抑制結腸癌LoVo細胞侵襲和遷移，通過肺腺癌轉移相關轉錄本1敲低和過表達發現，其機制與白藜蘆醇下調肺腺癌轉移相關轉錄本1進而抑制β-catenin的核轉運及其下游靶基因c-Myc和MMP-7的表達有關。

2.4抑制腫瘤血管生成 大黃素是存在于大黃、虎杖、何首烏等多種植物中的一種單蒽核類二羥基蒽醌衍生物[43]。金劍和趙慶[44]分別用10、20、40 mmol/L的大黃素對結腸癌SW480細胞移植瘤裸鼠灌胃，發現大黃素可以降低小鼠血清促血管生成因子(VEGF、血管生成素2、堿性成纖維細胞生長因子)水平；免疫組織化學顯示，腫瘤組織微血管密度和β-catenin表達水平亦下降，表明大黃素可能通過下調Wnt/β-catenin信號通路中的促血管生成因子表達來抑制移植瘤生長和微血管形成。

丹參酮ⅡA是唇形科植物丹參中的一種脂溶性化合物。劉宣[45]發現，環加氧酶2可以促進β-catenin核轉運，激活Wnt/β-catenin信號通路并上調VEGF的表達，而丹參酮ⅡA可通過減少環加氧酶2的表達抑制腸癌細胞和移植瘤裸鼠腫瘤的生長及腫瘤微血管的形成。

2.5增強化療敏感性 耐藥包括內在性耐藥和獲得性耐藥，其是導致化療失敗的常見原因，因此如何逆轉化療耐藥、增強化療敏感性是腫瘤臨床治療亟待解決的問題。王秋爽[46]用姜黃素聯合5-氟尿嘧啶及順鉑共培養結腸癌SW480和SW620細胞，發現其對細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響均優于單獨化療，表明姜黃素具有協同化療的作用；且機制研究顯示，與單獨化療相比，聯合用藥可以增加Wnt/β-catenin信號通路中AXIN的表達，減少β-catenin、上皮細胞黏附分子、端粒酶逆轉錄酶和微管相關蛋白-1表達。魏培等[47]分別用青蒿琥酯、順鉑及聯合用藥處理結腸癌LoVo細胞，結果發現青蒿琥酯可以增強順鉑對腫瘤細胞的增殖抑制和凋亡誘導，逆轉順鉑引起的β-catenin表達、β-catenin入核和TCF-1轉錄活性升高，表明青蒿琥酯可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路發揮對順鉑的增敏作用。

2.6抑制上皮-間充質轉化 上皮-間充質轉化與腫瘤的干細胞特性、侵襲遷移能力、化療藥物耐藥等行為相關[48]。龍景培等[49]用不同濃度的冬凌草甲素干預結腸癌LoVo細胞發現，冬凌草甲素可以抑制細胞增殖和上皮-間充質轉化，增加上皮標志物上皮鈣黏素基因表達，抑制間充質標志物波形蛋白基因表達，上調Wnt/β-catenin信號通路中磷酸化GSK-3β(酪氨酸216)蛋白的表達，下調磷酸化GSK-3β(絲氨酸9)和β-catenin蛋白的表達，而加入GSK-3β抑制劑可以逆轉冬凌草甲素對β-catenin、上皮鈣黏素、波形蛋白的干預，表明冬凌草甲素可能通過影響GSK-3β活性來負性調控Wnt/β-catenin信號通路實現對腫瘤細胞增殖和上皮-間充質轉化的抑制。

3 小 結

APC基因是家族性腺瘤性息肉病的主要原因，其在散發性結直腸癌中也有較高的突變頻率，由于APC和β-catenin突變，導致大腸癌中與Wnt/β-catenin信號通路相關的經典基因突變超過90%[50]。因此，與其他腫瘤相比，Wnt/β-catenin信號通路在結直腸癌中的作用更為突出。中藥單體可以通過Wnt/β-catenin信號通路干預腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲、腫瘤血管生成、化療敏感性和上皮-間充質轉化，進而在結直腸癌中發揮作用，但目前關于中藥單體的研究仍需結合新的檢測方法，不斷深入探索機制，以為結直腸癌的新藥研發提供基礎。