蛋白質糖基化在肺癌診療中的研究進展

王祎熙，李霞，許玲

(1.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院腫瘤一科，上海 200437； 2.上海市閔行區中西醫結合醫院中醫內科，上海 200241)

肺癌是全球范圍內發病率、致死率均較高的惡性腫瘤[1]。2015年，我國新發肺癌病例約78.7萬例，死亡病例約63.1萬例，居我國惡性腫瘤發病和死亡人數的首位[2]。由于肺癌發病初期無明顯癥狀，因此早期診斷率較低。低劑量CT檢查的靈敏度較高，是目前肺癌早期篩查的主要手段，但對早期肺癌診斷的特異度較低[3]，且存在假陽性率高和過度診斷等問題。而臨床常用的癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、細胞角蛋白19片段(cytokeratin-19-fragment，CYFRA21-1)、神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、糖類抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)以及鱗狀細胞癌相關抗原等肺癌血清腫瘤標志物的靈敏度均較低，均不可作為肺癌早期診斷的有效檢測指標。因此，亟須尋找一種有效的肺癌早期診斷指標。在細胞生長、發育、分化各個階段，糖基化修飾對蛋白質的結構和功能均具有調控作用，在腫瘤等病理狀態下，糖鏈結構會發生改變，導致蛋白質結構和功能異常。而糖復合物糖基化修飾異常是腫瘤細胞的主要特征之一[4]。同時，藥物的糖基化修飾可提高其對特定器官的靶向性，從而更好地發揮藥物的靶向傳遞功能。現就蛋白質糖基化在肺癌診療中的研究進展予以綜述。

1 蛋白質糖基化

蛋白質糖基化是重要的蛋白質翻譯后修飾，具有廣泛存在、結構復雜的特征，受一系列代謝和酶促反應網絡以及基因、環境等因素共同調控[5]，從而改變蛋白質結構和功能。真核生物體內的結構蛋白、轉錄因子、受體蛋白以及一些重要的酶類均需經過特定的糖基化修飾，使結構多樣化，從而具有更廣泛的生物學活性[6]。在某些特定病理狀態下，蛋白質的類型及數量均無顯著變化，但糖基化結構卻存在顯著差異[7]。

根據連接的氨基酸殘基不同，蛋白質糖基化可分為N-糖基化、O-糖基化和糖基磷脂酰肌醇，目前研究較多的為N-糖基化和O-糖基化。N-糖基化修飾是生物體內最豐富的蛋白質翻譯后修飾之一，血漿等體液中的蛋白質多發生N-糖基化修飾，N-糖基化修飾在內質網表面經糖基轉移酶催化形成N-連接聚糖分子，聚糖分子與新生成蛋白質的天冬酰胺殘基通過N-糖苷鍵連接，隨后進入內質網和高爾基體內進行一系列后續加工[8]。N-糖鏈家族由數目龐大的單糖構成，組成N-聚糖的常見單糖主要包括N-乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖、巖藻糖、半乳糖、甘露糖和唾液酸等，各種類型的糖鏈結構均發揮重要的調控功能，參與蛋白質的折疊、定位以及細胞-細胞間的相互作用等生物學過程[9]。O-糖基化主要存在于黏液蛋白、免疫球蛋白等分子中，與N-糖基化相比，O-糖基化結構更復雜且組成多變，O-糖基化由糖鏈與蛋白質絲氨酸或蘇氨酸殘基以共價形成結合，廣泛參與基因轉錄、細胞周期的調控、細胞代謝及蛋白質降解等生物學過程[5]。

2 蛋白質糖基化與肺癌

蛋白質糖基化可通過調控新生肽鏈的空間結構、定位及穩定性，參與細胞信號轉導、細胞識別與黏附、受體活化等生物學過程。N-糖基化、O-糖基化修飾是惡性腫瘤的普遍特征，在腫瘤細胞中，糖基轉移酶表達改變也可調控聚糖結構，導致蛋白質糖基化修飾異常[10]。與正常細胞相比，腫瘤細胞可出現糖基化密度增加、異常O-糖基化及其分支形成、唾液酸水平升高等多種異常糖基化類型[11]。異常的糖基化修飾可導致信號轉導、受體配體結合、分子黏附等生物學功能異常，在腫瘤的增殖、侵襲、轉移、凋亡、多重耐藥、免疫逃逸中起重要作用，并最終導致肺癌患者預后不良[12]。有證據表明，異常的糖基化修飾與肺癌的發生、發展及轉移均密切相關[13]。

2.1N-糖基化 N-糖基化修飾在肺癌發生發展的不同階段均有特征性表達。在早期肺腺癌組織中即發現了N-糖基化產物的特征性表達，與正常肺組織相比，早期肺腺癌組織中存在29種糖基化復合物的差異性表達，而糖基化復合物可部分反映腫瘤微環境變化[14]。同時，在肺癌的不同病理類型中N-糖基化也有差異性表達，參與N-糖基化的糖基轉移酶主要包括N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶(N-acetylglucosaminyltransferase，GnT)-Ⅴ和GnT-Ⅲ。正常肺組織可表達GnT-Ⅴ，而在約50%的非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者中存在GnT-Ⅴ表達減少或缺失[15]。在非鱗狀細胞癌中GnT-Ⅴ低表達更常見，且與患者較短的生存期相關，是非鱗狀細胞癌Ⅰ期切除患者的不利預后因素[16]。同時，GnT-Ⅲ和GnT-Ⅴ也與上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)密切相關，影響腫瘤的侵襲和轉移。GnT-Ⅲ是腫瘤相關EMT的抑制因子，主要修飾上皮鈣黏素(E-cadherin)并抑制β聯蛋白向胞核轉位。GnT-Ⅲ表達缺失可影響E-cadherin的糖基化修飾，導致E-cadherin在上皮細胞的定位異變，從而促進EMT的發生[17]。GnT-Ⅴ糖基化主要參與CD147調控的腫瘤相關EMT，對腫瘤相關EMT具有雙重調控作用。在肺腺癌A549細胞株中，GnT-Ⅴ過表達可通過下調轉化生長因子-β/Smad信號通路及其下游轉錄因子的表達抑制肺腺癌A549細胞的EMT過程，延緩肺癌的轉移和侵襲[18]。

2.2O-糖基化 O-糖基化修飾與腫瘤細胞的突變密切相關。人肺鱗癌組織中的蛋白質O-糖基化水平顯著高于鄰近的正常組織，從而促進肺癌細胞的惡性轉化[19]。Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(Kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS)是肺癌的驅動基因之一。研究表明，O-糖基化修飾可抑制KRASG120基因誘導的衰老過程，加速肺癌的發生，而O-糖基化缺失可延緩肺癌的發生[20]。

此外，O-糖基化水平升高還可促進肺癌細胞的增殖及遷移，協助腫瘤細胞逃避機體監視，導致腫瘤轉移及免疫逃逸[21]。沉默O-乙酰氨基葡萄糖轉移酶可導致蛋白質O-糖基化水平降低，顯著降低肺癌A549細胞株軟瓊脂集落形成能力和體外侵襲能力[22]。同時，糖基化在細胞免疫和體液免疫中也具有重要作用。β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶1失活可導致T細胞O-聚糖類型發生轉變，誘導CD8+T細胞凋亡或記憶性T細胞形成，從而影響細胞毒性T細胞的殺傷作用及細胞免疫反應[23]。此外，蛋白質的O-糖基化還與癌基因及抑癌基因的表達密切相關。抑癌基因p53第149位絲氨酸發生O-糖基化修飾，可導致泛素蛋白連接酶減少，進而抑制p53的降解，同時增強p53的穩定性并使其大量聚集，從而起到抑制細胞癌變的作用[24]。癌基因c-myc是細胞內重要的轉錄因子，c-myc第58位蘇氨酸殘基磷酸化可加速c-myc降解，而c-myc第58位蘇氨酸O-糖基化可阻止氨基酸殘基磷酸化，導致c-myc的穩定性增強，進而導致腫瘤的惡性轉化增加[25]。

2.3巖藻糖基化 巖藻糖基化是糖蛋白、糖脂寡糖修飾中最常見的修飾方式，由巖藻糖基轉移酶催化，主要參與ABO血型H抗原、Lewis血型抗原形成以及選擇素介導的白細胞外滲或淋巴細胞歸巢、病原宿主相互作用、信號轉導通路的修飾等[26]。

目前已知的人類巖藻糖基轉移酶有13種類型，其中巖藻糖基轉移酶1～11存在于高爾基體中并催化N-巖藻糖基化，蛋白氧巖藻糖轉移酶1/2則定位于內質網中并催化O-巖藻糖基化[27]。巖藻糖基化在不同腫瘤組織、同一組織不同病理類型中均存在較大差異[28]。哺乳動物中，核心巖藻糖基化是N-巖藻糖基化的主要類型，而巖藻糖基轉移酶8是負責核心巖藻糖基化的唯一酶[29]。在Ⅰ期NSCLC患者腫瘤組織中巖藻糖基轉移酶8的表達水平升高，而沉默巖藻糖基轉移酶8可抑制腫瘤的生長、轉移，且不影響正常肺上皮細胞的增殖，表明巖藻糖基轉移酶8高表達與肺癌惡化和患者的不良預后相關[30]。同時，巖藻糖基化還參與腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移過程。高表達的巖藻糖基化與腫瘤細胞的侵襲性相關，與CL1-0細胞系相比，巖藻糖基轉移酶8在肺腺癌CL1-5細胞系中的表達水平顯著升高，提示CL1-5細胞系具有較高的侵襲能力[31]。除巖藻糖基轉移酶8外，巖藻糖基轉移酶7和巖藻糖基轉移酶4也參與了肺癌細胞的侵襲和轉移過程。有學者通過質粒轉染法使肺癌A549細胞中過表達巖藻糖基轉移酶7基因，結果發現，A549細胞的侵襲能力顯著增強，且肺癌細胞中神經鈣黏素、波形蛋白的表達均上調，而E-cadherin表達下調，表明巖藻糖基轉移酶過表達可誘導A549細胞發生EMT[32]。沉默肺癌A549細胞巖藻糖基轉移酶4表達后，巖藻糖基化及路易斯寡糖-Y抗原水平均顯著降低，下調的巖藻糖基轉移酶4通過抑制促分裂原活化的蛋白激酶信號通路的激活從而抑制肺癌細胞的轉移、侵襲和EMT過程[33]。

3 糖基化在肺癌診療中的臨床應用

3.1糖基化在肺癌早期診斷中的應用 血清腫瘤標志物是目前臨床篩查早期肺癌的常用方法之一，但由于不同的肺癌病理類型會影響腫瘤標志物的表達，同時腫瘤標志物在不同個體中表達的差異也較大，因此血清腫瘤標志物在肺癌檢測中存在一定局限[34]。而糖基化標志物的檢測為肺癌的診斷提供了新思路，可能是肺癌早期診斷潛在的生物學標志物之一。

有研究運用凝集素微陣列法分析NSCLC患者與健康人群的N-聚糖譜和O-聚糖譜，結果發現，NSCLC患者疾病早期凝集素、加納籽凝集素-Ⅰ、雙花扁豆凝集素等10多種凝集素與健康人群存在顯著差異[35]。焦麗靜等[36]采用DNA測序儀熒光電泳技術檢測肺癌患者血清發現，N-糖組圖譜具有特征性表達：與健康對照者相比，肺癌患者N-糖組圖譜Peak1、Peak5、Peak9升高，而Peak3、Peak6、Peak11降低；與良性肺病患者相比，肺癌患者N-糖組圖譜Peak5、Peak9升高，Peak3、Peak4、Peak11降低；且N-糖組圖譜Peak1、Peak5、Peak9、Peak10、Peak11與肺癌TNM分期呈正相關；Peak3、Peak4、Peak6、Peak7、Peak8與肺癌TNM分期呈負相關。Chen等[37]通過檢測疾病特異性觸珠蛋白β鏈N-糖基化發現，Asn207/211位點的糖肽水平比例具有潛在區分良性肺部疾病與NSCLC的能力，其靈敏度為74.4%、特異度為82.8%。Tn抗原是O-糖基化常見的前體之一，Tn抗原可接受一個半乳糖單位形成T抗原，廣泛參與腫瘤細胞黏附與組織侵襲[38]。研究發現，肺腺癌患者的T/Tn抗原結合物木菠蘿凝集素、加納籽凝集素-Ⅰ、雙花扁豆凝集素水平均顯著升高，而肺鱗癌患者的木菠蘿凝集素、雙花扁豆凝集素水平均顯著降低，因此T/Tn抗原可作為區分NSCLC組織學亞型的潛在標志物[35]。

異常糖鏈糖蛋白(tumor abnormal protein，TAP)是腫瘤細胞增殖過程中的共同特征，與腫瘤密切相關。TAP檢測具有簡便、廣譜、高效的特點，對于腫瘤的篩查具有重要意義。研究表明，TAP檢測可作為肺癌早期診斷、病情分期較好的指標[39]。肺癌患者的TAP水平顯著高于健康人群，其檢測肺癌患者的靈敏度為83.25%、特異度為34.91%，且與血清CEA、NSE、CYFRA211相比，TAP的靈敏度顯著升高[3]。劉麗燕等[40]研究發現，在NSCLC患者中TAP陽性率高達86.67%，而在健康人群中TAP陽性率僅為3.33%，且Ⅰ～Ⅱ期NSCLC患者的TAP凝聚物面積小于Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者。此外，肺癌患者的TAP與傳統腫瘤標志物也具有相關性，對肺癌的診斷也具有一定的參考價值。肺癌患者血清CEA、CA125水平隨TAP增高而增高，同時不同病理類型的肺癌患者TAP亦與腫瘤標志物具有相關性，其中肺腺癌、鱗癌患者的TAP與CEA、CA125呈正相關，小細胞癌及未分類癌患者的TAP與CA125水平呈正相關[41]。TAP聯合肺癌傳統血清腫瘤標志物(CEA、NSE、CYFRA211)檢測，受試者工作特征曲線下面積顯著大于單純血清標志物檢測；同時，在CT檢測陽性(CT報告提示肺癌可能)的患者中，TAP檢測的特異度為40.0%，靈敏度為79.17%[3]。TAP、熱激蛋白90α以及腫瘤標志物(CEA、NSE、CYFRA211)聯合檢測小細胞肺癌，其受試者工作特征曲線下面積為0.901，檢測的靈敏度為92.00%、特異度為75.81%[42]。提示TAP聯合傳統血清腫瘤標志物及CT檢測可提高肺癌的診斷率。因此，TAP聯合腫瘤標志物等多參數檢測可彌補單一檢測手段的不足，提高肺癌診斷的準確率。

3.2糖基化在肺癌療效及預后評估中的應用 檢測TAP水平的變化對肺癌療效及預后評估均具有一定意義。TAP陰性提示腫瘤可能根除；TAP陰性或弱陽性，但在1個月后再次表達為陽性則提示腫瘤殘留或腫瘤轉移；TAP陰性1年后再次表達為陽性則提示腫瘤復發或轉移[43]。任占良等[43]發現，肺癌根治術聯合輔助化療治療后1個月、3個月，患者 TAP表達陽性率均較治療前顯著降低，而行單純化療治療前后患者的TAP表達陽性率無明顯變化。接受肺癌根治術聯合輔助化療治療2周后，Ⅰ～Ⅱ期NSCLC患者TAP凝聚物面積即開始減小，治療3個月后TAP凝聚物面積較治療前減少了79%；Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者TAP凝聚物的面積亦有所減少，其降低幅度為63%[40]。史英等[44]發現，TAP表達水平與肺癌患者TNM分期相關，TNM分期越晚，TAP表達水平越高；化療后再次檢測患者的TAP，發現部分緩解者的TAP水平較治療前顯著降低，而進展者的TAP水平較治療前顯著升高，穩定者的TAP水平則無顯著變化，提示TAP水平的動態變化對肺癌患者療效評估有一定的預測價值。

目前關于肺癌患者預后的判斷尚無統一標準，傳統的TNM分期在肺癌患者的預后評估中具有重要作用，但仍存在局限性。研究表明，NSCLC患者的TAP面積與生存時間呈負相關[45]。TAP陽性的肺癌患者3年生存率顯著低于TAP陰性患者，同時TAP陽性患者的淋巴結轉移率也顯著高于TAP陰性患者[46]。黃婷婷等[47]發現，肺癌合并胸腔積液及遠處轉移者的TAP水平顯著高于未合并者。因此，TAP水平在肺癌預后評估中也具有一定價值。

3.3糖基化修飾在肺靶向藥物傳遞系統中的應用 提高藥物在病變部位的濃度、最大限度地降低藥物的不良反應發生率是目前惡性腫瘤治療過程中亟須解決的問題。腫瘤細胞高表達葡萄糖轉運蛋白1，而葡萄糖轉運蛋白1可與無毒、無免疫原性、生物相容性以及降解度良好的相應糖基配體(甘露糖、半乳糖、葡萄糖等)產生特異性識別。糖基化藥物傳遞系統通過將抗腫瘤藥物定向轉運至靶區而發揮藥效，在腫瘤靶向治療中起重要作用[48]。肺癌細胞表面的葡萄糖轉運蛋白1與肺組織巨噬細胞表達的甘露糖受體產生特異性識別，通過內吞或轉運作用將攜帶特殊糖配體的藥物傳遞系統靶向傳送至肺部，減少藥物在其他臟器的分布，提高藥物的治療指數、減少不良反應發生[49]。有學者通過制備羥喜樹堿糖基化脂質體并注射給小鼠發現，脂質體主要被小鼠肺攝取，且與普通注射劑相比，羥喜樹堿在小鼠肺部停留的時間顯著延長，相對攝取率為60.72，肺靶向效率為17.57[50]。另外，經糖基化修飾的吉非替尼包合物脂質體在小鼠肺部聚集，導致小鼠肺部的藥物濃度顯著升高[51]。有研究將甘露糖結合的pH敏感靶向遞送吉非替尼納米載體系統運用于肺癌A549裸鼠異種移植模型，給藥后發現，裸鼠腫瘤組織內吉非替尼濃度顯著升高，與吉非替尼原料藥相比，應用該系統后吉非替尼藥物累積量升高了7倍，表明甘露糖結合的pH敏感靶向遞送吉非替尼納米載體系統對A549細胞有顯著抑制作用[52]。

4 小 結

“精準醫療”模式為肺癌患者帶來了更多的治療選擇，但目前臨床仍缺乏肺癌早期篩查、識別以及預后判斷的有效手段。異常的蛋白質糖基化修飾廣泛存在于肺癌發生、發展和轉移過程中，與肺癌的病理類型、病情分期等密切相關。而糖鏈檢測具有創傷性小、檢測周期短、可重復等優點，因此在肺癌早期診斷、治療、預后評估等方面具有潛在的臨床應用價值。另外，基于糖基化修飾的肺靶向藥物傳遞系統在肺癌的治療中也具有巨大潛力。但目前糖鏈檢測在肺癌中的應用尚缺乏大樣本的臨床數據，且缺乏統一的定量標準，因此仍存在局限性。未來隨著糖組學檢測技術的發展，可以更深入了解異常糖基化類型與肺癌的關系，并將糖組學檢測技術真正用于肺癌的臨床診療過程中。