微粒在血栓性疾病中的研究進展

孫宇婷，高春艷

(哈爾濱醫科大學(大慶)，黑龍江 大慶 163319)

隨著我國人口老齡化的進一步加劇以及人們生產和生活方式的改變，血栓性疾病已經逐漸成為嚴重威脅人類身體健康的疾病。根據發病部位，血栓性疾病可分為動脈血栓、靜脈血栓和微循環障礙等類型。血栓性疾病多由血管內皮損傷、血液高凝狀態和血流緩慢等因素引起。研究表明，微粒與血栓性疾病的發生、發展密切相關[1-2]。微粒是細胞活化或凋亡時細胞膜表面釋放的直徑為0.1～1 μm的囊泡，來源于血小板、紅細胞、白細胞、內皮細胞以及癌細胞。正常人循環中有一定數量的微粒，血栓性疾病患者循環微粒水平顯著高于正常人[1-2]。微粒不僅能表達具有很強促凝活性的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)和組織因子，而且還富含親代細胞抗原和信使RNA等多種生物活性物質[3]。微粒通過表面相互作用、受體激活和細胞融合等方式作用于靶細胞，繼而影響血栓性疾病的進程[4]。現就微粒在血栓性疾病中的研究現狀以及作用機制進行綜述，以期更好地預防和治療血栓性疾病。

1 微粒的概述

1.1微粒的產生 微粒是細胞活化或凋亡的產物。在靜息狀態下，細胞自發的跨膜雙分子層的脂質轉運非常緩慢。磷脂在脂質上分布的不對稱性是靜息細胞的共同特征：PS和磷脂酰乙醇胺被限制于質膜的內側；磷脂酰膽堿、神經鞘磷脂和鞘糖脂等被隔離到質膜外側。這種不對稱性是內向翻轉酶和外向翻轉酶的相反活動以及非特異性雙向ATP非依賴性脂質轉運體共同作用的結果。當細胞受凝血酶或鈣離子激動劑等刺激導致細胞活化或凋亡時，內向翻轉酶發生鈣依賴性抑制，外向翻轉酶和非特異性雙向ATP非依賴性脂質轉運體被激活，導致PS外翻[5]。細胞骨架的鈣依賴性蛋白水解導致質膜內外側的磷脂水平的最終瞬態失衡：PS外翻、磷脂酰膽堿水平降低和神經鞘磷脂逆向轉運[6]。這些引起質膜的不穩定以及微粒釋放。另外，鈣依賴性通道TMEM16F是一種八跨膜蛋白，其在鈣離子引起的血小板微粒形成過程中起關鍵作用[7]。

1.2微粒的生物學功能 微粒具有很強的促凝活性，其促凝血功能與PS和組織因子的表達有關。微粒暴露的PS與凝血因子FⅤ、FⅧ的C樣結構域選擇性結合，為凝血因子FⅤ、FⅧ和FⅩ的活化提供催化表面，促進凝血酶的生成[8]。其次，微粒暴露的組織因子是人體內生理性凝血的主要啟動因子，通過與凝血因子FⅦ/Ⅶa的相互作用啟動外源性凝血[9]。血小板衍生微粒的促凝血活性是活化血小板的50～100倍[10]。這些特性是微粒在止血的生理過程和血栓形成的病理過程中起作用的基礎。不僅如此，微粒攜帶的生物活性物質使其具有更為廣泛的作用，包括致動脈粥樣硬化、促炎、免疫調節，甚至抗凝。

1.3微粒的檢測 隨著檢測技術的發展，越來越多方便快捷的技術被用于微粒的鑒定。目前微粒的檢測技術包括流式細胞術、電子顯微鏡觀察、酶聯免疫吸附實驗、蛋白組學技術等。

1.3.1流式細胞術 流式細胞術是檢測微粒最常用的方法。一般情況下，通過已知大小的標準微球(直徑為1 μm的標準微球)設門，確定微粒在流式散點圖中的位置。由于膜聯蛋白與微粒的親和性，在研究中常用帶有熒光染料的膜聯蛋白來定義微粒。另外，由于不同種類的微粒也攜帶有各自親代細胞的表面標志物，如血小板膜糖蛋白CD41a、內皮細胞膜糖蛋白CD31等。膜糖蛋白與帶有熒光染料的膜聯蛋白聯合檢測常用來確定微粒的來源。膜聯蛋白在微粒的檢測中廣為應用，但膜聯蛋白檢測微粒可能存在的問題是微粒會在流式分析之前發生標本的“微凝集”。這是由于膜聯蛋白檢測微粒時需要加入鈣離子，鈣離子的加入可引起凝血級聯反應的發生，最終導致纖維蛋白凝塊“微凝集”形成，其形成大大減少了流式細胞儀檢測到的微粒數量[11]。有學者使用帶有熒光標記的乳黏素檢測微粒[12-13]。乳黏素與微粒有較強的親和性，且乳黏素與微粒結合時不需要鈣離子的介入，該特點使乳黏素檢測微粒更不易受鈣離子的影響。在不考慮經濟因素的情況下，乳黏素較膜聯蛋白更加適合檢測微粒。

1.3.2酶聯免疫吸附實驗 酶聯免疫吸附實驗也可用來檢測微粒。一種方法是將膜聯蛋白包被在微孔板的底部，然后將待測物加入微孔板中，清洗微孔板后，再次向微孔板中加入凝血酶原、Ⅹa因子、Ⅴa因子以及鈣離子的混合物。微粒表面的PS可使凝血酶原在Ⅹa因子和Ⅴa因子的存在下活化為凝血酶。凝血酶的生成量利用特定的顯色底物測定[14]。另一種方法是微粒結合到膜聯蛋白包被的微孔板后，由于微粒表面暴露組織因子，利用組織因子的抗體及過氧化物酶檢測微孔板中微粒的水平[15-16]。酶聯免疫吸附實驗的靈敏度不高，且無法明確微粒的數量，雖然較流式細胞術更為經濟、實惠，但實驗準確性無法保障。

2 微粒與血栓性疾病

2.1急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS) ACS是冠狀動脈粥樣斑塊破裂引起的血栓性疾病，通常由動脈粥樣硬化遷延而來。ACS患者的循環中具有高水平的微粒。巨噬細胞、紅細胞和平滑肌細胞是粥樣斑塊微粒的主要來源。微粒的促凝活性參與了ACS的發生發展。Liu等[17]研究發現，ACS患者的微粒水平是健康對照者的2.5倍，這些微粒表達的PS和組織因子通過啟動凝血級聯反應促進血栓形成。此外，微粒還通過促炎作用參與ACS的發展。Mavroudis等[18]對將要進行經皮冠狀動脈介入治療的ACS患者的冠狀動脈和右心房處的微粒水平和來源進行分析發現，病變處冠狀動脈總體微粒水平較高，微粒部分來自白細胞。病變處冠狀動脈具有更高水平的CD62P陽性和CD62E陽性微粒，這些微粒增加了血管炎癥的可能性：CD62P陽性微粒通過進一步募集表達P-選擇素糖蛋白配體的炎癥細胞而促進病變進展[19]；CD62E陽性微粒與P-選擇素糖蛋白配體結合介導炎癥細胞與活化內皮細胞的相互作用[20]；中性粒細胞衍生的微粒可通過與活化的內皮細胞結合，放大血管炎癥反應[21]。Diehl等[22]研究發現，溶血磷脂酰膽堿是血小板衍生微粒的主要成分，通過與血小板受體G2A受體相互作用，促進血小板的活化、擴散、遷移和聚集，最終導致血管炎癥。該研究還發現，在動脈粥樣硬化斑塊不穩定或破裂的小鼠模型中，溶血磷脂酰膽堿可作為斑塊不穩定的替代標志物。同樣，人的溶血磷脂酰膽堿在易損斑塊區也有較高的水平。推測微粒不但促進了血管炎癥的發生，還與斑塊不穩定性密切相關，微粒的產生增加了斑塊的不穩定性，提高了ACS的發病風險。除促炎和促凝外，微粒還可通過攜帶信使RNA的方式促進ACS的發展。Liu等[23]發現，包裝有miR-92a-3p的內皮細胞衍生微粒在ACS患者中顯著增加，這些微粒促進了內皮細胞或血管平滑肌細胞的遷移和增殖，加劇了動脈狹窄。綜上所述，微粒在ACS的發病機制中扮演重要角色，通過促炎、促凝和細胞間信息通信等方式參與疾病的發展。

2.2缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS) IS是目前致殘率極高的疾病之一，是由于腦的供血動脈狹窄、栓塞、腦供血不足導致的腦組織壞死。微粒通過促凝和促炎作用參與了IS的發展。Yao等[24]研究發現，IS循環中高水平的微粒通過暴露PS和組織因子促進血栓形成。He等[25]研究發現，與健康對照者相比，IS患者循環中白細胞衍生微粒數量增加，這些微粒通過炎癥作用促進IS的發展。白細胞衍生微粒的促炎作用主要通過升高腫瘤壞死因子、白細胞介素-6、活化蛋白C和白細胞介素-1β等炎癥因子的水平實現[26]。單核細胞/巨噬細胞衍生的微粒誘導核因子κB易位到細胞核中，導致白細胞介素-8產生增加[27]。另外，單核細胞/巨噬細胞衍生的微粒還可誘導腦微血管內皮細胞微粒的產生[28]。微粒不僅促進了IS的發生發展，還可調節神經系統的發育和再生。Varon等[29]發現，活化的血小板釋放的微粒能夠增強內源性神經祖細胞和干細胞血管的生成以及神經發生，有助于IS后的神經修復。Pan等[30]研究發現，內皮細胞衍生微粒對血腦屏障發揮作用。在IS的疾病過程中，常有血腦屏障的破壞，星形膠質細胞參與了血腦屏障的組成。正常培養條件下產生的內皮細胞衍生微粒促進星形膠質細胞的增殖，改善局部腦血流量，減少梗死體積；而在氧氣和葡萄糖剝奪的培養條件下產生的內皮細胞衍生微粒對星形膠質細胞有完全相反的作用[30]。推測微粒在IS中不僅僅促使疾病惡化，其對神經細胞的修復也減輕了IS對機體的損害。

2.3靜脈血栓栓塞(venous thromboembolism，VTE) VTE是指血液在靜脈內病理性凝結導致血管完全或不完全阻塞，屬靜脈回流障礙性疾病。VTE包括深靜脈血栓形成和肺血栓栓塞癥。手術外傷、限制活動或靜脈功能不全引起的靜脈瘀滯等是導致VTE的病理性原因，以上因素易引起各種凝血因子和促凝物質在病變部位濃縮，促進VTE發生。癌癥引起的VTE是近年研究的熱點，而VTE也是癌癥患者的常見并發癥。許多研究探討了來自癌細胞和癌癥患者的微粒的促凝機制，但研究大多集中在組織因子的作用上。癌癥患者組織因子陽性微粒的表達與VTE的發生發展可能存在相關性。Timp等[31]研究發現，癌癥患者VTE的風險增加了4～7倍，這是由于循環中腫瘤細胞衍生的組織因子陽性微粒引起了高凝狀態。Hisada等[32]將人源性胰腺癌細胞衍生微粒(pancreatic cancer cell-derived microparticle，pcMP)注入小鼠體內發現，pcMP促進了小鼠的VTE。目前，許多研究者已就腫瘤細胞衍生的組織因子陽性微粒促進VTE形成達成了共識。Stark等[33]認為，癌癥相關VTE的發病機制為：①pcMP衍生的組織因子不足以誘導VTE；②活化的血管內皮細胞可能提供了部分組織因子，這些組織因子與pcMP衍生的組織因子協同促進了VTE的發生；③磷脂酰乙醇胺支持FⅩa的生成，對pcMP的促凝血活性有重要作用。Stark等[33]的研究結果與公認的“腫瘤細胞衍生組織因子陽性微粒促進VTE”有所不同，說明微粒促進癌癥相關VTE的機制仍不完全清楚，需進一步探究。

2.4抗磷脂綜合征(antiphospholipid-antibody syndrome,APS) APS是一種以反復動脈或靜脈血栓、病態妊娠和抗磷脂抗體持續陽性為特征的疾病。APS的實驗室檢查中有診斷價值的抗磷脂抗體包括狼瘡抗凝物、抗心磷脂抗體和抗β2-糖蛋白Ⅰ(β2-glycoprotein Ⅰ，β2GPⅠ)抗體[34]。β2GPⅠ是APS的主要抗原。一直以來人們對微粒在APS中作用的認識僅限于β2GPⅠ參與清除循環中的微粒以及APS患者體內產生的微粒能夠促進血栓形成[35]。Mobarrez等[36]提出了新觀點，認為PS陰性微粒的積累可能參與了APS的發病機制，APS患者具有較健康對照者更低水平的β2GPⅠ陽性微粒。據推測，這可能是由于β2GPⅠ先與微粒表達的PS特異性結合，導致抗β2GPⅠ抗體與β2GPⅠ-PS的復合物結合。這一過程導致循環中β2GPⅠ陽性微粒水平降低，PS陰性微粒積累，微粒可能成為自身抗原的來源。以往很少有研究關注PS陰性微粒對APS的影響，Mobarrez等[36]的研究為APS的發病機制研究提供了新思路。

3 小 結

流式細胞術是目前檢測微粒最常用的方法。微粒暴露的PS和組織因子通過內源性和外源性凝血途徑促進血栓的形成。不僅如此，微粒還通過促炎、致動脈粥樣硬化、細胞間信息通信等多種方式影響了ACS、VTE和IS等血栓性疾病的進程。近年來，越來越多的研究致力于將微粒作為血栓性疾病的生物標志物，但現今微粒的檢測技術還存在較多缺點，未來需進一步優化微粒的檢測技術。明確微粒在血栓性疾病中的作用機制，有助于預防和診斷血栓性疾病，以期降低血栓性疾病的發病率和致死率。