冠心病細胞焦亡的分子機制及其新藥靶點的研究進展

劉超，高嘉良，王階

(1.中國中醫科學院廣安門醫院心內科，北京 100053； 2.北京中醫藥大學，北京 100029)

冠心病是一種嚴重威脅人類健康的疾病，其發病率高、致死風險大，已成為全球重要的公共衛生問題[1]。冠狀動脈粥樣硬化是冠心病發生的基本病理表現，既往研究證實，炎癥反應在斑塊形成、破裂、血管堵塞所致急性心血管事件中起重要作用[2-3]。細胞焦亡是由多種病原體或非感染因素刺激產生的一種固有免疫反應，是依賴胱天蛋白酶(caspase)1、4、5、11、炎癥小體以及GSDMD(Gasdermin D)蛋白的一種伴有炎癥反應的程序性細胞死亡模式[4-5]。細胞焦亡一詞最早來自希臘語“Pyroptosis”“pyro”意為“火”“ptosis”表示“下降”，pyroptosis表示細胞焦亡[6]。與細胞凋亡和細胞壞死不同，細胞焦亡既能表現出與細胞凋亡相似的細胞核皺縮、外吐小泡、DNA斷裂、Annexin V及原位末端轉移酶標記法染色陽性[7]，又能表現出與細胞壞死類似的細胞腫脹破裂、炎癥內容物釋放的特征[8]。細胞焦亡在炎癥反應中占據重要地位，并在冠心病相關炎癥反應中發揮重要作用[9-10]。部分研究證實，細胞焦亡會導致冠心病患者血液中炎癥因子的高表達[11-12]，并加速動脈粥樣硬化進展[13]；抑制細胞焦亡途徑的各個環節可有效抑制炎癥因子的釋放，延緩動脈粥樣硬化進展[14]，縮小心肌梗死面積，改善心功能[15]；同時針對冠心病細胞焦亡中的各靶點，相應特異性抑制劑的研發也已取得一定成果[16]。現就細胞焦亡在冠心病中的作用機制以及作為藥物靶點的研究進展進行綜述。

1 細胞焦亡相關信號通路

1.1經典信號通路 經典的細胞焦亡信號通路是依賴caspase-1介導的信號通路[17]。細胞通過病原體相關分子模式和損傷相關分子模式識別危險信號，激活細胞質內的模式識別受體[18]。模式識別受體被激活后，其熱蛋白結構域可以募集細胞質中的凋亡相關斑點樣蛋白，并與之結合，從而形成一個多蛋白復合物炎癥小體[19-21]。激活后的凋亡相關斑點樣蛋白結構域可以募集caspase-1前體，并將其水解成具有活性的caspase-1[8]，活化的caspase-1一方面可以切割GSDMD，使其N端結構(GSDMD-NT)暴露，進而特異性地與細胞膜內側的磷酸酰肌醇磷酸鹽、磷脂酰絲氨酸以及細胞膜內外側的心磷脂結合[22]，進而在細胞膜上打孔，使細胞膜表面形成10～14 nm蜂窩狀的孔洞結構，改變細胞通透性，造成細胞腫脹破裂，發生焦亡[17]。另一方面，caspase-1還可以切割未成熟的白細胞介素(interleukin，IL)-1β前體和IL-18前體，從而形成IL-1β和IL-18，當細胞焦亡發生時，兩種炎癥因子大量釋放，促進炎癥級聯反應的發生[22-23]。經典細胞焦亡信號通路的研究較為深入，是目前炎癥疾病研究的熱點。

1.2非經典信號通路 非經典的細胞焦亡信號通路由人源caspase-4、5和鼠源caspase-11所介導[24-25]。與復雜的經典通路不同，革蘭陰性菌的內毒素脂多糖可直接激活caspase-4、5、11，進而切割GSDMD，使其N端結構域暴露，誘發GSDMD-NT在細胞膜上打孔，導致細胞通透性改變，進而發生細胞焦亡[26]。同時，激活的caspase-4、5、11也可以活化核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein，NLRP)3炎癥小體，進而激活經典的焦亡信號通路[27]。活化的caspase-4、5、11可以激活細胞膜表面控制小分子物質進出的Pannexin-1通道釋放ATP，進而激活細胞膜表面對ATP敏感的嘌呤能離子通道型受體7，導致細胞膜表面形成小孔，誘導焦亡發生[28]。此外，激活的Pannexin-1通道還可通過釋放K+激活NLRP3炎癥小體，活化caspase-1，從而激活經典的細胞焦亡通路[29]。目前對細胞焦亡非經典信號通路的研究尚不全面，其與經典信號通路之間的聯系還有待深入研究。

1.3信號通路關鍵蛋白 GSDMD是Gasdermin蛋白家族中的一種重要蛋白，具有Gasdermin結構域，是所有caspase的共同底物，其能夠在細胞膜上形成孔洞結構，促進細胞焦亡發生，是細胞焦亡經典途徑和非經典途徑發生的最后執行蛋白[26,30]。人源GSDMD由487個氨基酸和2個結構域[N端(Gasdermin-NT)和C端(Gasdermin-CT)]組成[31]。正常狀態下，兩個結構域相互結合，處于無活性的抑制狀態，caspace活化后可特異性地切割GSDMD中兩個結構域的連接區，進而暴露N端結構域，從而使其可以特異性地識別細胞膜上的磷脂類分子，并在細胞膜表面打孔，導致細胞滲透壓改變，細胞腫脹破裂，引發細胞焦亡[32]。當敲除GSDMD基因時可阻止細胞釋放IL-1β以及炎癥小體和脂多糖引發的細胞焦亡，證實了GSDMD在細胞焦亡中的關鍵作用[33]。此外，Gasdermin蛋白家族中的另一種蛋白GSDME(Gasdermin E)可被caspase-3切割，暴露GSDME的N端結構域，與GSDMD-NT類似，GSDME-NT可特異性地與細胞膜表面脂質體結合，在細胞膜表面形成孔洞結構，誘發細胞焦亡[34-35]。多年來caspase-3一直被認為是誘發細胞凋亡的關鍵因子，而其對GSDME的特異性切割、誘發細胞焦亡的現象建立起細胞凋亡向細胞焦亡轉變的新途徑[36]。

2 冠心病細胞焦亡過程與新藥作用靶點

2.1炎癥小體 炎癥小體是固有免疫反應的重要組成部分，是調控細胞焦亡的關鍵環節。目前發現參與細胞焦亡的炎癥小體主要有NLRP3、NLRP1、NLRC4(NLR family,CARD domain containing 4)、黑素瘤缺失基因2炎癥小體、Pyrin[37]，其中NLRP3研究最多，在冠心病的發生、發展中占重要地位[38]。研究發現，急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)和急性心肌梗死患者外周血中存在NLRP3的高表達，且NLRP3水平會隨冠狀動脈病變以及分叉病變數量的增加而升高[12,39-40]。NLRP3會增加冠狀動脈壁中IL-1β的積累，并提高caspase-1的活性，導致冠狀動脈內側壁增厚，加速冠狀動脈粥樣硬化的進展，故NLRP3很可能成為預測冠心病的潛在生物標志物[41]。研究發現，與野生型小鼠相比，敲除NLRP3基因小鼠的心功能改善更明顯，缺氧損傷較輕，并認為NLRP3可能是導致心肌缺血再灌注期間心肌梗死面積增加的重要因素[42]。

自噬是抗炎的重要環節，能夠抑制NLRP3所介導的炎癥反應，通過激活心肌細胞的自噬途徑增加微管相關蛋白1輕鏈3Ⅱ/Ⅰ的水平，降低p62的表達水平，抑制NLRP3形成，減少心肌缺血再灌注損傷[43]。針對NLRP3的特異性抑制劑已有動物和細胞研究證實，OLT1177[44]、MCC950[45]、Calpain[46]和黃芩苷[47]等可有效抑制NLRP3/ASC/caspase-1軸的激活，下調IL-1β、IL-18的表達，抑制早期炎癥反應，減輕心肌損害，改善心功能。可見NLRP3不僅有潛力成為冠心病的特異性生物標志物，也可能成為冠心病治療的重要靶點。

目前，針對其他炎癥小體的研究相對較少。有研究發現，NLRC4在ACS患者中存在遺傳變異，而這種變異會導致血清IL-18的高表達和caspase-1前體的激活，進而誘發細胞焦亡[48]。此外，NLRP1炎癥小體介導的心肌缺血再灌注損傷也可由內質網應激通過核因子κB信號通路激活[49]。冠心病患者Pyrin等位基因M694V高表達，增加了其罹患急性心肌梗死的風險[50]。然而并不是所有的NLRC4都會促進細胞焦亡的發生，如線粒體中的NLRX1(NLR family member X1)在急性心肌梗死組織和缺氧誘導的H9C2細胞中顯著減少，并通過抑制線粒體抗病毒信號蛋白、NLRP3和caspase-1的表達，減少細胞焦亡，起到保護心肌細胞的作用[51]。

2.2caspase家族 caspase家族主要參與細胞程序性死亡，其中caspase-1、4、5、11調控細胞焦亡[5]，caspase-3、6、7、8、9、10則是細胞凋亡的執行者[52]。參與細胞焦亡的caspase不僅能促進IL-1β、IL-18成熟，還能切割GSDMD，誘導細胞焦亡發生，特別是經典途徑中caspase-1在冠心病中的研究較為深入。研究發現，冠心病患者主動脈caspase-1水平顯著升高，并與冠狀動脈Gensini評分、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和脂蛋白α呈顯著正相關(P<0.05)，與高密度脂蛋白膽固醇呈負相關(P<0.05)，故認為caspase-1有可能成為防治冠心病的潛在靶點[53]。此外，抑制caspase-1的表達可在上游環節調控炎癥因子的釋放，有效減輕心肌缺血再灌注損傷[54]。進一步敲除caspase-1基因，可顯著降低心肌缺血再灌注損傷小鼠血漿中基質金屬蛋白酶3的活性和減少IL-18的表達，提高心肌梗死區周圍心肌的存活率，降低心室擴張率，改善心功能[55]。僅有少數研究開展了針對非經典途徑中caspase的研究，心肌缺血再灌注損傷可導致caspase-11升高，可通過調節p38促分裂原活化的蛋白激酶途徑抑制caspase-11活化、保護心肌細胞[56-57]。

VX765是caspase-1的特異性抑制劑，通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路減輕心肌缺血再灌注損傷[58]。而另一種特異性抑制劑Ac-YVAD-cmk能顯著抑制caspase-1的活性，減輕高膽固醇血癥對心肌缺血再灌注損傷的不利影響[59]。秋水仙堿可顯著減少ACS患者casapase-1信使RNA和蛋白的表達，降低IL-1β水平，抑制炎癥反應，改善心功能[60]。另外，盾葉冠心寧片[15]和α-1-抗胰蛋白酶[61]可通過腺苷酸激活蛋白激酶途徑抑制caspase-1的活性，減少IL-1β的釋放，保護存活心肌，縮小心肌梗死面積，延緩心室重構的發生。caspase-1是冠心病細胞焦亡發生的關鍵調控因子，特異性抑制可能成為冠心病治療的新途徑。

2.3IL-1β和IL-18 IL-1β和IL-18是重要的致炎因子，會導致局部劇烈的炎癥反應[62]。既往研究已經證實，冠狀動脈粥樣硬化斑塊的形成與炎癥反應密不可分[63]，而細胞焦亡釋放的炎癥因子IL-1β和IL-18會造成局部的炎癥級聯反應，在冠心病的發生中起重要作用。研究發現，在發生急性血管事件后，ACS患者心臟局部炎癥因子IL-1β和IL-18的水平顯著升高[64]，且這種高水平狀態會持續6個月；多元回歸分析顯示，IL-1β水平與低密度脂蛋白膽固醇以及IL-18水平呈正相關，與高密度脂蛋白膽固醇水平呈負相關[65]，而IL-18的基線水平可直接反映患者的預后狀況[66]。一項薈萃分析顯示，IL-18rs187238和IL-18rs1946518是心血管疾病的易感基因，其表達會增加人群罹患冠心病的風險[67]。IL-1β和IL-18水平升高是患者發生急性心血管事件的特征表現之一，為了抑制此炎癥反應的發生，正在研發相應藥物。

卡納單抗是炎癥因子IL-1β的單克隆抗體。在一項涉及40個國家10 061例心肌梗死患者的多中心、隨機、雙盲、安慰劑對照臨床試驗中，特異性IL-1β單抗卡納單抗可以顯著降低心肌梗死患者心血管不良事件的發生率(HR=0.75，95%CI0.66～0.85，P<0.000 1)[16]。此外，IL-1β能夠誘導可溶性生長刺激表達基因2蛋白的表達，加速急性心肌梗死后的心力衰竭，而依普利酮能夠拮抗這一效應，提高左心功能[68]。另外，中藥川芎提取物可通過調節Toll樣受體4/核因子κB信號通路抑制心肌IL-1β的表達，提高射血分數，縮小心肌梗死面積[69]。IL-18可加重心肌梗死后的心功能障礙，燈盞花素可通過降低體內IL-18和細胞間黏附分子-1的水平，減輕炎癥反應，降低IL-18對心肌梗死后左心室重構的不良影響，達到延緩冠心病進展的目的[70-71]。綜上可知，IL-1β和IL-18是冠心病細胞焦亡發生炎癥反應的重要途徑，是抑制冠心病炎癥反應的重要靶點。

2.4GSDMD GSDMD是細胞焦亡過程中caspase-1、4、5、11的共同底物，其GSDMD-NT在細胞膜表面可發揮打孔作用，直接誘導細胞焦亡發生和炎癥因子IL-1β、IL-18釋放，是細胞焦亡發生最關鍵的蛋白質。GSDMD基因敲除會顯著減少焦亡相關炎癥因子的釋放[72]。因此有學者主張將細胞焦亡定義為由GSDMD介導的細胞程序性死亡[30,33]。GSDMD在多種缺血性疾病的細胞焦亡中起重要作用[31,73]，并與冠心病密切相關，但對GSDMD的研究較少。臨床研究發現，急性心肌梗死會導致焦亡相關蛋白GSDMD和GSDMD-NT水平升高，進而誘發巨噬細胞的細胞焦亡和下游的炎癥反應[74]，而新型蒽醌類化合物琥珀酸Kanglexin能夠阻止這一有害改變，并預防心臟損害和心功能不全[75]。動物研究發現，心肌缺血再灌注損傷會導致心肌細胞GSDMD-NT水平升高，大黃素可通過Toll樣受體4/髓樣分化因子88/核因子κB/NLRP3途徑抑制NLRP3介導的細胞焦亡，提高心肌細胞存活率，縮小心肌梗死面積，預防心室重構[76-77]。

動脈粥樣硬化是冠心病的基本病理表現，延緩斑塊進展是治療冠心病的關鍵。高脂飲食會導致體內GSDMD-NT升高，其含量同氧化低密度脂蛋白水平呈濃度依賴關系[78]。降脂藥阿托伐他汀可通過長鏈非編碼RNA NEXN-AS1/NEXN途徑降低GSDMD、IL-1β和IL-18的水平，從而抑制細胞焦亡，起到抗動脈粥樣硬化的作用[14]。此外，紅景天苷能夠抑制GSDMD的表達，減少IL-1β釋放，降低細胞焦亡導致的炎癥級聯反應，達到抗炎、延緩斑塊進展的目的[79]。目前雖沒有針對GSDMD的特異性抑制劑，但GSDMD作為細胞焦亡發生的共同底物，在治療中展現出廣闊的應用前景。

3 小 結

細胞焦亡在冠心病炎癥反應中占重要地位，能夠加速動脈粥樣硬化的進展，從細胞焦亡途徑研究冠心病的發病機制及新藥作用靶點有廣泛的應用前景。然而，目前細胞焦亡的機制尚不清楚，如缺乏對細胞焦亡非經典途徑的深入研究，經典途徑與非經典是否存在聯系，細胞焦亡與細胞凋亡、細胞自噬之間是否存在拮抗關系，打孔蛋白GSDMD的核心機制等均不明確。同時，臨床患者的病情往往較復雜，而現有冠心病細胞焦亡動物模型多采用缺血再灌注損傷模型，該模型能否真實反映臨床實際情況還有待商榷。此外，針對細胞焦亡靶點中特異性抑制劑或基因敲除技術的研究還相對較少，無法明確各靶點在冠心病發生中的地位和作用。中醫藥具有多環節、多途徑、多靶點作用的特點，而目前針對中藥單體及提取物的研究僅局限于某一特定靶點，從多靶點、多環節抑制細胞焦亡還有待研究。因此，未來應深入探討冠心病細胞焦亡的發病機制，并針對細胞焦亡的各環節、各靶點研制新的特異性抑制劑，并進行多中心、大樣本隨機對照試驗，以期為冠心病的防治提供新策略。