骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療脊髓損傷應(yīng)用方法的多樣性

劉明昊，于才勇，劉玲，王曦

(空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，a.學(xué)員一大隊(duì)，b.神經(jīng)生物學(xué)教研室暨腦科學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，西安 710032)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一類因創(chuàng)傷、腫瘤、缺氧、炎癥等因素造成的脊髓完整性和連續(xù)性被破壞的疾病。近年來，SCI患者呈逐年增多趨勢，且以青壯年居多。中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元損傷后難以再生，造成SCI患者肢體和內(nèi)臟功能恢復(fù)困難，給患者造成極大痛苦，同時(shí)也給患者的家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)被發(fā)現(xiàn)以來，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用一直是學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。移植BMSCs對(duì)于SCI患者具有顯著的治療作用，可改善SCI患者的預(yù)后，其內(nèi)在機(jī)制可能由于BMSCs具有顯著的神經(jīng)營養(yǎng)、調(diào)節(jié)免疫平衡、抗氧化應(yīng)激和抗凋亡等作用；在體外培養(yǎng)條件下BMSCs還具有跨胚層分化的能力，可提高突觸傳遞功能，促進(jìn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，改善后肢運(yùn)動(dòng)功能；此外，BMSCs可自身獲得，因此可以有效避免免疫排斥反應(yīng)[1-2]。這些特性使BMSCs成為治療SCI的理想候選細(xì)胞。BMSCs治療SCI有多種不同的應(yīng)用方法，通過不同的機(jī)制發(fā)揮作用，產(chǎn)生不同的治療效果。現(xiàn)就BMSCs治療SCI的應(yīng)用方法的多樣性予以綜述。

1 BMSCs概述

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類源于中胚層且具有自我更新和多項(xiàng)分化潛能的多能干細(xì)胞，其中BMSCs最早被發(fā)現(xiàn)，而骨髓也被認(rèn)為是MSCs臨床應(yīng)用的主要來源之一[3]。1970年，F(xiàn)riedenstein等[4]首次發(fā)現(xiàn)來自骨髓的某種細(xì)胞可以在塑膠培養(yǎng)基上形成集落；1991年，Caplan[5]將這種細(xì)胞命名為BMSCs，同時(shí)發(fā)現(xiàn)BMSCs具有分化形成骨、軟骨和脂肪的潛能。目前，國際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)建議通過以下標(biāo)準(zhǔn)識(shí)別BMSCs：可以黏附在塑膠上；在標(biāo)準(zhǔn)的體外分化條件下可分化為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞；可表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD105、CD73和CD90，且不表達(dá)CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19以及人類白細(xì)胞抗原DR等[6]。

2 BMSCs治療SCI的多種應(yīng)用方法及其作用機(jī)制

BMSCs可以跨胚層分化為屬于外胚層來源的神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞[7]，并具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化應(yīng)激和抗凋亡等作用，因此在減輕SCI后的繼發(fā)性損傷方面具有廣闊的應(yīng)用前景，是一種被廣泛研究的成體干細(xì)胞[8]。目前BMSCs治療SCI具有多種應(yīng)用方法，主要包括：直接移植體外培養(yǎng)擴(kuò)增的BMSCs、僅應(yīng)用BMSCs分泌的活性物質(zhì)治療SCI、體外誘導(dǎo)分化BMSCs為神經(jīng)干細(xì)胞或前體細(xì)胞后再移植、用特定基因干預(yù)BMSCs后再移植以及BMSCs移植聯(lián)合其他方法治療SCI等。

2.1直接移植體外培養(yǎng)擴(kuò)增的BMSCs 目前可以通過多種途徑直接移植BMSCs治療SCI，主要包括將BMSCs直接注射到損傷脊髓局部、鞘內(nèi)注射、靜脈注射或腹腔注射[9-10]。BMSCs具有“歸巢”的特性，移植后會(huì)向損傷位點(diǎn)遷移[1]。移植體外培養(yǎng)擴(kuò)增的BMSCs后，脊髓局部的表現(xiàn)和功能會(huì)顯著改善，炎癥反應(yīng)緩解，細(xì)胞凋亡減輕[11]；出血反應(yīng)與瘢痕纖維化減輕[12]；血脊髓屏障的完整性得到鞏固[13]；軸突再生和再髓鞘形成能力提高，神經(jīng)通路的重新構(gòu)建增強(qiáng)[14]。在這種情況下，BMSCs發(fā)揮治療作用主要通過神經(jīng)營養(yǎng)、調(diào)控免疫平衡以及抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡等機(jī)制。BMSCs可以通過分泌生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophin，NT)起到神經(jīng)營養(yǎng)的作用，促進(jìn)神經(jīng)元再生[15-18]。SCI后，過度的炎癥反應(yīng)是引起繼發(fā)性SCI的重要原因之一，調(diào)控免疫平衡、抑制過度的促炎癥反應(yīng)以及增強(qiáng)有利于愈合和再生的因子的合成和釋放，是治療SCI的重要策略之一，而移植BMSCs能夠發(fā)揮這種作用[19-20]。氧化應(yīng)激反應(yīng)是引起SCI后繼發(fā)性損傷的另一重要因素，如何抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)也是治療SCI的重要策略之一，而BMSCs可以通過抑制氧化應(yīng)激，減輕繼發(fā)性損傷，達(dá)到治療的目的[21]。SCI后，一系列引起繼發(fā)性損傷的因素均會(huì)導(dǎo)致殘存的神經(jīng)元凋亡，進(jìn)一步加重?fù)p傷，而移植的BMSCs可以通過多種途徑抑制神經(jīng)元凋亡[22-24]，促進(jìn)SCI大鼠的功能恢復(fù)。學(xué)者們陸續(xù)開展了多項(xiàng)臨床試驗(yàn)，初步結(jié)果顯示移植BMSCs后患者的運(yùn)動(dòng)、感覺以及膀胱功能改善，表明移植BMSCs安全可行，且能提高SCI患者的生活質(zhì)量[1-2,9,25]。

2.2應(yīng)用BMSCs分泌的活性物質(zhì)治療SCI SCI后，損傷區(qū)的微環(huán)境不利于移植細(xì)胞的存活，且移植細(xì)胞在體內(nèi)的存活和分化方向難以控制，阻礙了移植細(xì)胞作用的發(fā)揮。直接利用BMSCs分泌的活性物質(zhì)治療SCI，可避免這些不利因素。BMSCs可以分泌眾多有利于組織修復(fù)和再生的物質(zhì)，包括多種營養(yǎng)因子、免疫調(diào)節(jié)因子、含有生物活性分子的外泌體等[1]。研究發(fā)現(xiàn)，給大鼠注射BMSCs的條件性培養(yǎng)液，可以顯著減輕SCI，促進(jìn)SCI后的功能恢復(fù)[26-29]，說明BMSCs條件性培養(yǎng)液中含有BMSCs分泌的促進(jìn)脊髓再生和修復(fù)的物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，條件性培養(yǎng)液可以減輕凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)[30]。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，條件性培養(yǎng)液中至少含有120種蛋白質(zhì)分子，包括表皮細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、血管內(nèi)皮生長因子、血管緊張素、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)、睫狀生長因子、白細(xì)胞介素-10以及白細(xì)胞介素受體拮抗劑等眾多促進(jìn)神經(jīng)再生和組織修復(fù)的分子[31]。蛋白質(zhì)組學(xué)證實(shí)，條件性培養(yǎng)液中含有豐富的神經(jīng)營養(yǎng)、血管生成和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白分子[32]。近年研究還發(fā)現(xiàn)，靜脈注射BMSCs分泌的外泌體也可以促進(jìn)SCI后的功能修復(fù)[33]。BMSCs來源的外泌體可以通過抑制A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[34]或作用于M2型巨噬細(xì)胞發(fā)揮作用[35]，促進(jìn)損傷脊髓環(huán)境中星形膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向有利于再生和修復(fù)的表型轉(zhuǎn)化。

2.3體外誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)前體細(xì)胞后再移植 雖然神經(jīng)干/前體細(xì)胞是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一種良好的候選細(xì)胞，但倫理、法律和來源的制約限制了神經(jīng)干/前體細(xì)胞的應(yīng)用。而BMSCs可以由自身獲得，避免了免疫排斥反應(yīng)和倫理、法規(guī)的制約，因此很多研究通過BMSCs跨胚層分化來獲取神經(jīng)干/前體細(xì)胞，然后再移植治療不同的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

多種因素可以促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)干/前體細(xì)胞的跨胚層分化。BDNF、神經(jīng)生長因子、GDNF、FGF-2等多種生長因子可以促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)元或神經(jīng)前體細(xì)胞分化[36-37]。聲波、電刺激、抗氧化劑等多種方法也可以誘導(dǎo)BMSCs的跨胚層分化[38-40]。不同類型的RNA[如長鏈非編碼RNA[41]和微RNA(microRNA，miRNA)[42]]也被證實(shí)在BMSCs向神經(jīng)元分化過程中發(fā)揮重要作用。還有研究發(fā)現(xiàn)，SCI患者和多發(fā)性硬化患者血液中的自身反應(yīng)性T細(xì)胞均可在體外誘導(dǎo)BMSCs跨胚層分化[43]。

BMSCs可以跨胚層分化為多種神經(jīng)細(xì)胞，如多巴胺能神經(jīng)元[44]、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞[45]、少突膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞[46]、5-羥色胺能神經(jīng)元[47]、神經(jīng)前體細(xì)胞[37]、神經(jīng)元樣細(xì)胞與膠質(zhì)樣細(xì)胞[48]等，體現(xiàn)出通過細(xì)胞替代方法治療帕金森病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病、脫髓鞘疾病、5-羥色胺失調(diào)的精神失常性疾病、SCI等疾病的應(yīng)用前景。Ye等[49]用腦脊液誘導(dǎo)BMSCs分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞，并將其移植到大鼠損傷的脊髓，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BDNF、神經(jīng)生長因子及神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(neurotrophin-3,NT-3)的含量均增加，功能恢復(fù)也得到顯著改善。de la Garza-Castro等[50]研究發(fā)現(xiàn)，與直接移植BMSCs相比，將BMSCs轉(zhuǎn)化為施萬細(xì)胞前體細(xì)胞后再移植治療的SCI大鼠活動(dòng)能力和被移植細(xì)胞的遷移率均進(jìn)一步提高。由此可見，與移植腦和脊髓來源的神經(jīng)干/前體細(xì)胞相比，BMSCs跨胚層分化獲取的神經(jīng)干/前體細(xì)胞避免了倫理、法規(guī)與來源的約束，而與直接移植BMSCs相比，移植BMSCs跨胚層分化獲取的神經(jīng)干/前體細(xì)胞對(duì)SCI患者的治療針對(duì)性更強(qiáng)，具有一定的臨床意義。

2.4基因干預(yù)BMSCs后再移植 將某些有利于神經(jīng)再生的基因轉(zhuǎn)染至BMSCs后再移植到SCI患者體內(nèi)，對(duì)于SCI后的功能恢復(fù)具有更好的療效。如將分別轉(zhuǎn)染了音猬因子[51]、堿性FGF[52]、血管內(nèi)皮生長因子[53]、GDNF[54]、miR-124[55]、Bcl-2[56]或miR-200a[57]基因的BMSCs移植到SCI大鼠，均有效促進(jìn)了BMSCs的存活，增加神經(jīng)纖維的再生和軸突生長，促進(jìn)了運(yùn)動(dòng)和感覺功能的恢復(fù)；此外，miR-544[58]、miR-29b[59]或miR-126[60]基因修飾的BMSCs釋放的外泌體亦更加有效地促進(jìn)了SCI大鼠的軸突再生和運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。這些研究均提示，BMSCs經(jīng)過基因干預(yù)后再移植，在治療SCI方面具有良好的應(yīng)用前景。

2.5BMSCs移植聯(lián)合其他方法治療SCI

2.5.1BMSCs移植聯(lián)合應(yīng)用生長因子 生長因子是通過與特異性細(xì)胞膜受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與其他功能效應(yīng)的多肽類物質(zhì)。研究證實(shí)，將生長因子與BMSCs移植聯(lián)合治療SCI是一種有效的治療方法[2]。Shin等[61]將FGF-2與BMSCs移植聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)FGF-2對(duì)移植的BMSCs具有增殖、保護(hù)和神經(jīng)誘導(dǎo)作用，可提高BMSCs移植后的存活率，并顯著改善了SCI癥狀。黃興銳等[62]將堿性FGF與BMSCs聯(lián)合應(yīng)用后發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)纖維酸性蛋白的表達(dá)減少，神經(jīng)絲蛋白200的表達(dá)上調(diào)，殘余軸突受到保護(hù)，促進(jìn)了修復(fù)與再生，大鼠的運(yùn)動(dòng)功能也得到有效改善。表明FGF-2與BMSCs移植聯(lián)合應(yīng)用，一方面可以促進(jìn)移植的BMSCs存活，另一方面通過疊加或協(xié)同發(fā)揮治療作用，是一種有效的治療策略。

2.5.2BMSCs移植聯(lián)合電針刺激 電針療法是指在針刺入人體穴位后，在針上通以接近人體生物電的微量低頻脈沖電流進(jìn)行刺激來防治疾病的一種療法，與BMSCs移植聯(lián)合應(yīng)用，可以促進(jìn)SCI后的功能恢復(fù)。王文峰和葉紅暉[63]研究發(fā)現(xiàn)，電針聯(lián)合BMSCs移植可促進(jìn)BMSCs存活以及向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。Ding等[64]通過移植經(jīng)酪氨酸激酶C基因修飾的BMSCs并聯(lián)合電針療法治療SCI，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可通過提高脊髓NT-3水平，上調(diào)神經(jīng)源性因子層粘連蛋白和生長相關(guān)蛋白-43的表達(dá)，下調(diào)膠質(zhì)纖維酸性蛋白和硫酸軟骨素蛋白聚糖的表達(dá)，增加皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位的傳導(dǎo)，提高后肢運(yùn)動(dòng)功能。Liu等[65]還發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合電針療法治療可以促進(jìn)移植的BMSCs分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，促進(jìn)軸突再髓鞘化。雖然電針本身的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，但BMSCs聯(lián)合電針治療SCI的效果肯定，電針刺激有可能改善了BMSCs發(fā)揮作用的微環(huán)境，因此也是一種應(yīng)用前景廣泛的治療策略。

2.5.3BMSCs聯(lián)合其他細(xì)胞移植 研究已經(jīng)證實(shí)，單獨(dú)移植神經(jīng)干/前體細(xì)胞、少突前體細(xì)胞或嗅鞘細(xì)胞等可以提高SCI后的功能恢復(fù)[66-68]，而與BMSCs聯(lián)合移植，將進(jìn)一步提高SCI的治療效果。脊髓脫髓鞘是SCI中常見的一種病理改變，Kaka等[69]將BMSCs轉(zhuǎn)分化的少突前體細(xì)胞與未分化的BMSCs聯(lián)合移植到損傷的大鼠脊髓，結(jié)果顯示，脊髓空洞化程度降低，BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)評(píng)分顯著提高。Wu等[70]將嗅鞘細(xì)胞與BMSCs聯(lián)合移植到損傷的大鼠脊髓，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)修復(fù)效果與抗凋亡作用較單純的嗅鞘細(xì)胞或BMSCs移植更顯著。Stewart等[71]應(yīng)用過表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1的BMSCs與神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合移植治療SCI大鼠，發(fā)現(xiàn)通過BMSCs過表達(dá)產(chǎn)生的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1作用于神經(jīng)干細(xì)胞，更有利于軸突再生和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。這些研究提示，BMSCs與其他細(xì)胞聯(lián)合移植可通過功能互補(bǔ)和協(xié)同作用促進(jìn)SCI后的修復(fù)。

2.5.4BMSCs聯(lián)合組織工程支架移植 在SCI的治療過程中，脊髓空洞和膠質(zhì)瘢痕形成的物理屏障限制了移植的BMSCs發(fā)揮作用，而組織工程支架可以在一定程度上克服物理屏障，為BMSCs提供良好的增殖、分化與遷移環(huán)境，使BMSCs發(fā)揮更好的效果。將BMSCs作為種子細(xì)胞，與生物性可降解支架相結(jié)合，在SCI的治療中有巨大的應(yīng)用前景。Zeng等[72]將高表達(dá)NT-3的施萬細(xì)胞與高表達(dá)NT-3受體酪氨酸激酶C的BMSCs在三維明膠海綿支架中共培養(yǎng)14 d，結(jié)果支架中產(chǎn)生了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，全細(xì)胞膜片鉗記錄到自發(fā)性突觸后電流；將支架與細(xì)胞一起移植到大鼠脊髓橫斷間隙8周后，大鼠后肢功能和皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位均得到改善。Kim等[73]將BMSCs與殼聚糖支架或體外聚乳酸-糖基乙酸支架聯(lián)合移植，結(jié)果顯示其細(xì)胞移植成功率較單純BMSCs移植高，并具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用，運(yùn)動(dòng)功能改善顯著。Chen等[74]將具有微通道和H型腔的管狀支架與BMSCs共同移植治療SCI，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)了神經(jīng)再生，抑制了神經(jīng)元凋亡。Wang等[75]將BMSCs植入無細(xì)胞脊髓支架治療SCI大鼠，結(jié)果證明其可以恢復(fù)受損脊髓的功能；且使用具有無細(xì)胞脊髓支架的BMSCs可減少損傷部位的巨噬細(xì)胞，通過早期調(diào)控炎癥細(xì)胞募集，抑制凋亡和繼發(fā)性炎癥，促進(jìn)功能恢復(fù)。以上研究表明，聯(lián)合應(yīng)用生物支架有利于移植的BMSCs存活、克服物理屏障、調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境、抑制神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)SCI部位神經(jīng)元再生以及功能性突觸的形成，同時(shí)促進(jìn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，對(duì)SCI損傷后的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建和功能恢復(fù)具有重要作用。

3 小 結(jié)

BMSCs是目前治療SCI理想的候選細(xì)胞。BMSCs治療SCI的應(yīng)用方法具有多樣性，可以直接移植使用或使用其分泌產(chǎn)物，也可以體外跨胚層分化為神經(jīng)干/前體細(xì)胞后再移植，還可以經(jīng)過基因修飾后再移植，或聯(lián)合其他方法治療SCI。目前還應(yīng)進(jìn)一步研究如何在SCI后復(fù)雜的微環(huán)境中提高移植細(xì)胞的存活率以及調(diào)控移植細(xì)胞的分化命運(yùn)，并對(duì)比不同應(yīng)用方法的優(yōu)勢和特點(diǎn)，針對(duì)不同SCI患者情況找到更加有效的應(yīng)用方式，使BMSCs發(fā)揮最佳的治療效果。相信未來BMSCs可以安全、有效地應(yīng)用到SCI的臨床治療中，為不同SCI患者的康復(fù)提供有效的個(gè)性化治療策略。