二代測序技術(shù)在膿毒癥病原學(xué)診斷中應(yīng)用進展

張瑤璐 盧中秋

膿毒癥是一種宿主對感染反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致器官功能障礙的臨床綜合征，是世界上最常見的危重癥之一[1]。近年來，盡管在診斷和治療方面均有進展，但短期病死率仍居高不下[2]。正確的治療策略對于膿毒癥患者來說至關(guān)重要，而成功治療的關(guān)鍵在于確診為膿毒癥后盡早使用抗菌藥物。若不能及時使用抗菌藥物，膿毒癥患者的住院病死率就會大大增加[3]。病原學(xué)培養(yǎng)技術(shù)是診斷膿毒癥病原體的金標準，但其存在著一些不足，例如，病原體培養(yǎng)所需的時間過長，患者提前使用廣譜抗生素導(dǎo)致無法培養(yǎng)出致病菌,無法鑒定除了可培養(yǎng)的細菌和真菌外的微生物等[4～6]。因此，尋找檢測范圍廣、不受抗菌藥物干擾并且快速有效的診斷方法對膿毒癥病原體的診斷將有極大的幫助。

近年來，二代測序技術(shù)發(fā)展迅速，已被證明是遺傳性疾病基因診斷的有效手段[7]。同時，二代測序技術(shù)也在感染性疾病的病原學(xué)診斷中逐步得到應(yīng)用，為感染性疾病的準確診斷提供了更多的可靠依據(jù)。2014年，Wilson等[8]報道了二代測序技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病病原學(xué)診斷中的病例。此后，較多報道介紹了二代測序技術(shù)在膿毒癥病原學(xué)診斷中的應(yīng)用，故本文對此進行綜述。

一、二代測序技術(shù)概述

二代測序技術(shù)(又稱為高通量或大規(guī)模并行測序技術(shù))作為一種新興的分子診斷方法，可在一次測序過程中對樣本中的所有核酸片段進行檢測，既可檢測出人類基因組，也可檢測出樣本中病原體的核酸序列。二代測序技術(shù)的特點是進行合成和延伸的同時進行測序，測序速度比第一代測序快，測序通量也較第一代測序高。二代測序的病原體檢測的范圍，遠大于常規(guī)的血培養(yǎng)病原學(xué)檢測，不僅包括細菌、真菌，還包括病毒、寄生蟲等[9]。近年來使用二代測序技術(shù)的成本已經(jīng)顯著降低[10]。此外，與Sanger測序技術(shù)比較，二代測序技術(shù)不需要靶特異性引物，其優(yōu)勢是通過一次程序的運行，既能識別全部病原體，還能鑒別病原體的分型。因此，該技術(shù)在臨床上可為醫(yī)師的疾病判斷提供更多有效的信息[11]。

二代測序技術(shù)在臨床實驗室中最常見的應(yīng)用包括：(1)全基因組測序：對目標病原體進行測序，獲得完整的基因組信息，用于評估流行性疾病中的遺傳關(guān)系、鑒定新物種等。(2)靶向二代測序：用擴增或探針雜交的方法進行基因富集，即使用16S rDNA細菌圖譜或PCR擴增指定目標核酸片段，然后應(yīng)用二代測序技術(shù)進行檢測。(3)宏基因組二代測序：是一種對樣本中全部核酸[DNA和(或)RNA]進行平行測序的方法，可同時從樣本中分離和擴增出宿主和病原體的核酸序列[12]。現(xiàn)有的技術(shù)平臺主要包括Roche/454 GS FLX、Illumina/Solexa GenomeAnalyzer、Helicos BioSciences公司的HeliScopeTMSingle Molecule Sequencer、美國Dana-her Motion公司的Polonator；以及連接法測序，即通過引物來定位核酸信息，技術(shù)平臺有Applied Biosystems/SOLiDTMsystem。

二、二代測序技術(shù)在膿毒癥病原學(xué)診斷中的應(yīng)用

1.病原體檢測：對疾病進行快速診斷并獲得準確的病原學(xué)資料對于有效的治療至關(guān)重要。大量病例報告和臨床研究表明，二代測序技術(shù)可以用于檢測腦脊液、呼吸道分泌物、糞便、尿液和血液等中的病原體，能夠提高包括膿毒癥在內(nèi)的感染性疾病病原學(xué)診斷的準確性、及時性，為精準治療提供可靠的保障[8,13～17]。 Grumaz等[17]在2016年報道了首例基于游離循環(huán)DNA(circulating free DNA，cfDNA)的研究，即使用來自膿毒癥患者和未感染對照組的血漿樣本對膿毒癥病原體進行定量測序診斷。該研究建立了膿毒癥指示性量化指標(sepsis indicating quantifier，SIQ)評分，該指標為病原體的豐度和在膿毒癥中致病作用大小的乘積。

SIQ評分作為評估病原體致病性的定量評分，可以在測序結(jié)果中將病原菌的信號讀數(shù)從污染物或共生物種中區(qū)分出來。該研究嘗試將cfDNA的定量結(jié)果作為膿毒癥的診斷和預(yù)后標志。由于cfDNA的半衰期很短，獲得的SIQ評分在感染過程中呈動態(tài)變化，因此，微生物來源的SIQ評分可以反映感染的動態(tài)變化，用于監(jiān)測患者的病情發(fā)展和評價對治療的反應(yīng)。該團隊在另一項研究中基于二代測序技術(shù)，使用SIQ評分來定量診斷侵襲性真菌感染[18]。該研究表明應(yīng)用二代測序技術(shù)可以：(1)驗證經(jīng)血培養(yǎng)診斷出的念珠菌血癥。(2)檢測出早期血培養(yǎng)陰性的侵襲性真菌感染。(3)糾正被誤診為真菌定植，實則為侵襲性真菌感染的診斷。

Grumaz等[19]在一項包括50例膿毒癥患者和20例未感染的擇期手術(shù)患者作為對照組的研究中發(fā)現(xiàn)，28天的研究期間內(nèi)二代測序診斷病原體的陽性率比血培養(yǎng)高6倍以上，這表明基于二代測序技術(shù)的分子檢測技術(shù)為鑒定臨床相關(guān)病原體提供了一個有價值的診斷平臺，患者有可能從測序診斷中獲得更合適的治療。

Long等[20]在北京協(xié)和醫(yī)院重癥監(jiān)護室(ICU)開展的單中心研究中包括來自78例ICU患者和10例健康志愿者的血漿樣本。78份疑似菌血癥患者的血漿標本通過二代測序和血培養(yǎng)進行分析，10份健康志愿者的血漿標本作為陰性對照進行二代測序分析，以校準和設(shè)定檢測閾值。研究顯示，就細菌和真菌而言，7個樣本血培養(yǎng)和測序均呈陽性，3個樣本血培養(yǎng)陽性而測序陰性，8個樣本血培養(yǎng)陰性而測序陽性。以培養(yǎng)為標準，二代測序的敏感度和特異性分別為72.7%和89.6%。另外，在14個樣本中應(yīng)用測序發(fā)現(xiàn)了病毒感染，這說明二代測序技術(shù)可以同時診斷病毒和細菌病原體。然而，在培養(yǎng)中只有細菌或真菌可被檢測到。這一測序優(yōu)勢能通過一次性測試更全面了解患者的感染范圍。當把血培養(yǎng)和測序結(jié)合起來時，診斷為陽性的樣本數(shù)量從12.82%增加到23.08%，這為建立治療方案提供了更準確的信息。

2.鑒別污染菌(“排除”檢測)：在疾病評估中確認感染源和排除感染源同樣重要。二代測序能夠同時檢測樣本中存在的DNA和RNA病毒、細菌、真菌和寄生蟲，因此其在排除感染方面似乎比常規(guī)的檢測方法更有說服力。Gosiewski等[21]使用二代測序技術(shù)對健康受試者和膿毒癥患者的血液樣本進行檢測，以確定健康人群和膿毒癥患者血液中的細菌分類情況。研究表明，在健康受試者中，觀察到血液中厭氧菌的數(shù)量明顯占優(yōu)勢(76.2%)，其中以雙歧桿菌目細菌(73.0%)居多。在膿毒癥患者中，檢測到的大多數(shù)屬于需氧或微需氧細菌(75.1%)。放線菌門的豐度在膿毒癥中下降最為顯著(P=0.000)，變形菌門在健康受試者中下降(P=0.000)。

Grumaz等[17]研究發(fā)現(xiàn)，像痤瘡丙酸桿菌這樣常見的皮膚共生菌的標準化讀數(shù)在所有樣品之間都存在顯著差異，尤其是在未受感染的對照組中檢測到更高的豐度。利用這類數(shù)據(jù)，可為在膿毒癥中鑒別致病菌提供依據(jù)。許多研究表明，二代測序技術(shù)的診斷性能，包括陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值，均強于臨床上常用的檢測方法[22]。在一項前瞻性研究中，Salzberg等[23]從活檢中保留了10例疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的腦組織，使用二代測序技術(shù)檢測腦組織中的潛在病原體。在5例患者中獲得了陰性或非特異性測序結(jié)果，以此推斷為無活動性感染。該結(jié)論在后期的病理檢查和有效的類固醇治療中得到驗證。可靠的陰性測序結(jié)果有助于支持無病原體感染的判斷，這能夠幫助醫(yī)生減少對活動性感染的擔憂。隨著二代測序技術(shù)工作流程的改善和診斷準確性的提高，該技術(shù)將在排除感染方面發(fā)揮更大的作用。

3.病原體耐藥基因識別：及時、有效地應(yīng)用抗菌藥物對治療膿毒癥至關(guān)重要。常規(guī)的藥敏試驗通常在已經(jīng)分離好的病原體上進行，這些方法非常耗時，并進一步忽略了難以培養(yǎng)及不可培養(yǎng)的細菌[24]。二代測序能夠?qū)Σ≡w的整個基因組進行測序，因此在識別細菌抗生素耐藥性基因上具有巨大的潛力[25]。二代測序技術(shù)是一種非靶向方法，理論上可以檢測包括抗生素耐藥基因在內(nèi)的所有基因。Grumaz等[17]分析了1例在肝移植后出現(xiàn)膿毒癥癥狀的59歲女性的血漿樣本，對其血漿cfDNA進行測序，檢測出納入了CARD數(shù)據(jù)庫中的抗性基因，包括vanB、vanSB、tet1和sat4，且其檢測結(jié)果與微生物學(xué)測試相符，顯示病原體為抗萬古霉素腸球菌，對萬古霉素和四環(huán)素具有耐藥性。因此，若有足量的序列覆蓋，使用二代測序技術(shù)檢測抗生素耐藥性基因似乎是可行的。但是，目前研究中細菌和真菌測序的覆蓋率仍然較低，往往只能滿足物種鑒定的需要，不能有效地全面覆蓋抗生素耐藥基因的檢測。因此，在測序獲得病原體診斷結(jié)果后，臨床醫(yī)生仍需根據(jù)經(jīng)驗選擇抗生素。這一缺點可能與血液中病原體的核酸含量遠低于宿主的核酸含量，且cfDNA的半衰期較短有關(guān)[26]。目前，二代測序技術(shù)在膿毒癥診斷中的應(yīng)用仍集中在病原體鑒定上，在抗生素耐藥性的檢測上缺少系統(tǒng)性的研究，未來有望在此方面開展深入研究。

三、展 望

膿毒癥的診斷是一個挑戰(zhàn)。運用二代測序技術(shù)檢測病原體的潛力已經(jīng)在許多研究和臨床中得到證實，而且其在診斷膿毒癥方面也顯示出巨大的影響力。二代測序技術(shù)在包括膿毒癥在內(nèi)的感染性疾病診斷中也存在著許多亟待解決的問題。例如，標本中存在的微生物污染、運輸及操作過程造成的污染及實驗室環(huán)境的污染，都可能導(dǎo)致測序結(jié)果的準確度下降，增加檢測結(jié)果分析的困難。因此，檢測人員在操作過程需要遵守無菌原則，并且要建立完善的質(zhì)量控制體系。由于測序技術(shù)的非特異性，檢測出的微生物同時包括定植菌、污染菌和致病菌，增加了結(jié)果判讀的復(fù)雜性和難度。

綜上所述，cfDNA定量分析在一定程度上有助于致病菌的判讀。未來有望通過建立統(tǒng)一的數(shù)據(jù)庫平臺或者統(tǒng)計模型對測序結(jié)果進行排序和優(yōu)化，排除正常微生物群和環(huán)境污染物的干擾，加之臨床醫(yī)生對患者自身情況和臨床表現(xiàn)的綜合分析來確定致病菌。同時，多數(shù)二代測序平臺完成從采樣到最終結(jié)果的分析需要24～72h(平均為48h)。而在檢測病毒感染的技術(shù)中，特異性聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)可在12h內(nèi)完成病毒的鑒定，二代測序技術(shù)尚不能達到這個速度。二代測序檢測感染性疾病病原體的費用高于任何一種常規(guī)檢測手段，是其廣泛應(yīng)用于臨床的一大阻礙。但測序技術(shù)在樣本處理、工作流程建立、檢測時間和費用設(shè)定等方面存在的不完善之處都是暫時的，會被迅速發(fā)展的技術(shù)所克服。隨著臨床實踐經(jīng)驗和評估的增多，二代測序技術(shù)在診斷膿毒癥方面的臨床應(yīng)用價值將進一步提高。