MicroRNA與肝纖維化相關的研究進展

音銘 李文庭

肝纖維化是肝臟的一種損傷-修復過程，其特征就是細胞外基質(Extra cellular matrix，ECM)過度增生并沉積在肝臟，導致肝臟結構和功能的異常。肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活和增殖是肝纖維化發生、發展的中心環節[1-2]。肝活檢被認為是評價纖維化的金標準。然而，該技術有創，可重復性差，這些特點限制了其臨床應用。目前無創診斷方法越來越受到人們的推崇，臨床上常用的無創診斷包括基于影像的無創診斷模型和基于血清學指標的無創診斷模型，但目前的模型診斷準確性會受肥胖、高黃疸等多種因素的影響，且其特異性和敏感性較低，所以應用在臨床實踐中準確性不高[3]。目前，越來越多的研究學者都在尋找敏感性、可靠性高的肝纖維化無創生物標志物。

MicroRNA(miRNA)是一種長約22個左右核苷酸的內源性非編碼單鏈小RNA，通過調節RNA的轉錄以及轉錄后修飾等生物學過程來調節相關基因表達[4]。miRNA不僅存在于各種組織和細胞中，還穩定地存在于循環血液中。已有研究表明，miRNAs可以通過靶向與肝星狀細胞活化、免疫細胞反應和肝細胞凋亡相關的分子過程中的底物結合來調控肝纖維化進程[5-7]。在這篇綜述中，我們將分析miRNA在肝纖維化進展中的作用，并為肝臟纖維化的診斷和分子靶向治療提供新的思路。

一、抑制肝纖維化進展的miRNA

(一)miR-185 miR-185由人體22q11.21染色體上的基因編碼，它最初被描述為癌癥進展的調節因子。大量研究顯示，miR-185與肝病關系密切。Li等[8]對149例患者(肝癌40例，肝硬化54例，慢性丙型肝炎患者55例)及45名健康對照者血清標本進行測序，結果顯示，肝癌患者血清miR-185水平明顯低于肝硬化患者，進一步統計學分析表明，miR-185具有良好的肝癌診斷價值。同樣，miR-185在HBV及相關肝癌的發病機制中發揮重要作用。體外研究顯示，miR-185-5p能與肝細胞核內轉錄因子ELK1結合，顯著抑制HBV蛋白表達及HBV復制；在肝細胞內過表達ELK1能促進HBV復制，且能逆轉miR-185-5p對HBV復制的抑制效應[9]。

miR-185與纖維化的關系也得到了證實。Sun等[10]研究顯示，TGF-β1通過內質網應激(Endoplasmic reticulum,ER)促進HK2細胞(人腎上皮細胞系)活化并表達ɑ-SMA，促進腎纖維化的進展；此機制是通過上調HK2細胞ATF6(activating transcription factor 6)實現的；miRNA-185可與ATF6結合，下調ATF6活性，抑制HK2細胞活化。同時，在單側尿道梗阻小鼠模型(unilateral urethral obstruction,UUO)，miR-185-5p能顯著抑制腎纖維化的進展。Wang等[11]研究顯示，miR-451與星狀細胞XPO-1結合，上調miR-185活性，兩者均與EphB2(Erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2)結合，下調EphB2表達，從而抑制星狀細胞活化。同樣，該機制在CCl4誘導的肝纖維化小鼠模型中得到驗證。這些結果提示miR-185可能成為肝纖維化治療的新靶點。

(二)miR-29 新近研究顯示，miR-29在組織纖維化過程中發揮抑制作用。Huang等[12]探索了miR-29a在非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)中的作用。研究人員構建了miR-29a轉基因小鼠并給予高脂飲食誘導NAFLD小鼠模型。結果顯示，miR-29a轉基因小鼠(miR-29a+NAFLD)體質量明顯低于NAFLD模型小鼠；miR-29a能減少NAFLD小鼠肝臟膠原纖維(collagen1ɑ1,Col1A1)沉積，降低肝組織IL-6、MCP-1、過氧化物酶體增生物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)等炎癥因子表達。進一步細胞實驗表明，miR-29a通過抑制肝細胞CD36表達發揮抗肝纖維化作用。Xu等[13]深入探索了組氨酸脫甲基酶KDM4/miR-29與星狀細胞活化的關系。研究結果顯示，與靜息星狀細胞(Hepatic stellate cells，HSCs)相比，活化的HSCs高表達Acta2，但其KDM4明顯低于靜息HSCs。研究團隊還分離了小鼠原代HSCs，在原代HSCs活化過程中，KDM4水平逐漸降低。敲除KDM4能加速HSCs活化，同時miR-29水平明顯降低。進一步研究顯示，KDM4與SREBP2結合促進miR-29，從而抑制HSCs活化。

Wang等[14]深入研究了miR-29a在HSCs活化及肝纖維化進程中的作用。研究者構建了miR-29a轉基因小鼠，結果顯示，與正常小鼠相比，miR-29a轉基因小鼠肝組織α-平滑肌肌動蛋白(α-SMΑ)明顯減弱。在膽道結扎小鼠模型(bile duct-ligation,BDL),過表達miR-29a后小鼠肝纖維化減弱，伴隨著肝組織BRD4(bromodomain-4 protein)表達下降。過表達miR-29a后，HSCs增殖和遷移能力明顯下降，同時BRD4和EZH2(Enhancer of Zeste Homolog 2)表達減弱。據此，miR-29a通過下調BRD4活性，發揮抗纖維化作用。miR-29a類似物或可成為治療肝纖維化的新療法。

(三)miR-9 新近發現miR-9與纖維化關系密切。Han等[15]深入探索了miR-9在肺纖維化中的作用機制。研究人員發現，人體纖維化肺組織NEAT1表達高于正常組織，而miR-9水平低于正常肺組織，兩者呈負相關。在細胞實驗中，TGF-β1刺激下人肺腺癌細胞A549及人支氣管上皮細胞活化，高表達NEAT1、膠原纖維Ⅰ(Collagen Ⅰ)、膠原纖維Ⅲ(Collagen Ⅲ)和α-SMA，而miR-9水平明顯降低，敲除NEAT1或過表達miR-9均可逆轉這種效應，提示NEAT1可與miR-9結合，抑制miR-9活性，促進纖維化進展。在博來霉素(bleomycin,BLM)誘導的肺纖維化小鼠模型中，肺組織纖維化分級明顯高于正常小鼠，敲除小鼠NEAT1后，肺纖維化分級明顯降低，這說明NEAT1/miR-9能在肺纖維化進展中發揮重要作用。

Tu等[16]探索了miR-9-3p在肝病發病機制中的作用。結果顯示，miR-9-3p在肝癌組織中的水平明顯低于正常肝組織，高表達miR-9-3p后，肝癌細胞遷移及侵襲能力明顯下降，說明miR-9-3p在肝病中發揮重要作用。Fu等[17]深入探索了miR-9與肝纖維化的關系，結果表明，在人體肝組織中，隨著纖維化分級升高，多藥耐藥相關蛋白1(MRP1)表達增強，而miR-9水平降低。在星狀細胞活化過程中，可觀察到類似趨勢。miR-9能明顯降低HSCs的增殖活性，減少細胞外基質的表達，抑制miR-9活性能逆轉這種效應。深入研究顯示，miR-9能與MRP1結合，抑制MRP1表達及Hedgehog信號通路活性，發揮抗纖維化效應，這也在進一步的動物實驗中得以證實。Dong等[18]研究表明，miR-9-5p可通過調節TGF-β受體1(TGFBR1)和TGF-β受體2(TGFBR2)抑制TGF-β1途徑的HSC活化。以上研究均表明miRNA-9具有抗肝纖維化的潛力。

二、促進肝纖維化的miRNA

(一)miR-942 miR-942是近年來發現的與肝癌細胞相關的一種新的miRNA，Zhang等[19]研究顯示，抑制miR-942水平后，肝癌細胞的遷移、侵襲及糖酵解能力明顯下降；circ_0001445(一種Circular RNA)能顯著抑制miR-942活性，從而延緩肝癌進展。Liu等[20]研究顯示，活化HSCs高表達miR-942；且在HBV患者中，隨著纖維化分級的升高，miR-942水平增加，提示miR-942可以作為一種生物標志物來評估肝纖維化的分級。

PPARγ在靜息的HSCs中表達豐富，抑制PPARγ的表達可以促進HSCs的激活。PPARγ激動劑能抑制HSC表達α平滑肌肌動蛋白(α smooth muscle actin，α-SMA)和膠原纖維COL1A2。Tao等[21]研究證實，PPARγ水平隨著肝纖維化分期的增加而降低，并且與慢性乙型肝炎患者肝組織纖維化分級和HSC中α-SMA的表達呈負相關。同時發現PPARγ3′UTR是miR-942的作用靶點，miR-942的過表達可以抑制PPARγ，而敲除miR-942可促進PPARγ的表達。所以，miR-942通過抑制PPARγ促進HSC活化，可能成為未來肝纖維化的重要治療靶點。

(二)miR-212 TGF β/Smads 信號通路在肝纖維化中起著至關重要的作用。TGF-β1是重要的促纖維化細胞因子,它促進靜息HSCs活化并分泌大量的ECM,這是肝纖維化的關鍵機制。TGF-β1家族成員通過連接細胞膜受體(I 型和 II型)來傳導信號通路。TGF-β1連接受體后激活下游SMAD2 和 SMAD3以及SMAD4,這是一個穩定而復雜的磷酸化過程。SMAD7 是 TGF-β1信號通路抑制劑,可與活化型 I 受體結合,阻斷 SMAD2/3 的磷酸化，它也可以聯合泛素 E3 連接酶,使TGF β1受體 I泛素化和降解。在體內，肝細胞特異 SMAD7 減少可激活TGF β并介導纖維化形成。

Zhu等[22]在體外實驗中證實，miR-212可以通過活化 TGF β1信號通路來誘導 HSC 的活化,上調α-SMA和collagen在HSC的表達。而且，miR-212 可以直接作用于SMAD7，抑制SMAD7 的 mRNA 和蛋白質表達。這說明miR-212可以通過SMAD7靶向調節TGF-β1信號通路促進HSCs活化。因此，miR-212亦有望成為新的肝纖維化標志物及治療靶點。

(三)miR-200c miR-200系列，包括miR-200a、miR-200b、miR-200c等，其中miR-200a表達上調可抑制TGF-β1誘導的HSC活化和增殖，miR-200b的上調通過PI3K/Akt信號通路刺激HSCs的增殖和遷移，然而，很少有報道提到miR-200c在HSC激活和肝纖維化中的作用。

為了探究miR-200c在人(HSC)肝星狀細胞活化和肝纖維化進展中的作用，Ma等[23]開展了相關研究，其實驗數據表明，miR-200c高表達可以上調HSCα-平滑肌肌動蛋白(SMA)、波形蛋白、I型膠原蛋白和表皮生長因子(EGF)的表達，同時，miR-200c可能通過下調FOG2蛋白表達促進PI3K/Akt信號活化，從而激活HSC，誘導肝纖維化形成。因此，miR-200c是 HSCs活性、增殖和遷移的重要促進因素,在肝纖維化中具有非常重要的作用。miR-200c可能是HSC活化和肝纖維化進展的潛在標志物，甚至是治療肝纖維化的潛在靶點。

總之，肝纖維化的機制非常復雜，在外源性因素的刺激下，靜息HSC被激活，轉化為肌成纖維細胞，并分泌出ECM，最終導致肝纖維化。一些研究表明，肝纖維化的發生、發展與眾多信號通路有關，包括MAPK信號通路、NF-κB信號通路、TGFβ/Smad等[24-25]。miRNA 是人體中一類基因表達調控因子，它可以通過靶向調節肝纖維化相關信號通路調控肝星狀細胞活性，從而發揮促纖維化或抗纖維化作用。盡管目前證實miRNA在肝纖維化病理過程中作用機制的發揮了重要作用，但我們對miRNA的認識仍非常有限，需要進一步研究來明確其調控肝纖維化進展的機制。更重要的是，隨著臨床研究的廣泛開展，會發現越來越多的miRNA的肝纖維化診斷價值，其具有重要的臨床意義。