牙髓干細胞在周圍神經損傷修復中的研究進展

許曉航， 徐婉秋， 姚麗紅， 王秀梅

哈爾濱醫科大學附屬第二醫院口腔內科，黑龍江 哈爾濱（150001）

創傷引起的口腔頜面部周圍神經損傷（periph?eral nerves injury，PNI）是口腔醫學臨床常見病，這種傷害常來源于外傷或手術失誤，表現為手術部位周圍疼痛、功能喪失、美觀異常。與中樞神經系統相比，外周神經系統在損傷后具有自行再生的潛力，但是結果并不理想，約有三分之一的PNI 患者日常生活仍存在極大困擾［1］。目前，牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）治療是一種極具潛力的PNI 修復方法，它不僅具有間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的特性，還具有分化為中胚層細胞的能力及沿著神經譜系分化的潛力［2］。DPSCs 在組織工程學修復、周圍神經再生、疾病重塑和治療中已經取得了一定的進展，本文就DPSCs 同雪旺細胞（Schwanncs，SCs）的關系、分類及其在組織工程學方向的研究進展作一綜述。

1 DPSCs 可分化為SCs

MSCs 可以從多種組織中分離出來，它們最常從骨髓或脂肪組織中獲得［3］，也可來源于牙髓組織。可從脫落的乳牙中獲取人脫落的乳牙牙髓干細 胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED），從第三恒磨牙或正畸拔除的恒牙中獲得人恒牙牙髓干細胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs），臨床應用時不會對患者造成額外的損傷因而更容易被患者接受。研究顯示DPSCs同其他類型間充質干細胞相比具有來源豐富、提取簡單、免疫原性低以及體外增殖率高等優點［4］，即使經過傳代培養或長期冷凍保存，仍具有牙源性、骨源性、軟骨源性、神經源性、脂肪源性和肌源性等多向分化能力［5］。

1.1 SCs 在PNI 中的作用

當頜面部周圍神經截斷性損傷后，軸突近端通常可以存活，而遠端受損則會迅速閉合并在損傷后3 天內發生強制性瓦勒變性［6］。在瓦勒變性的過程中SCs 不但具有誘導細胞自噬的能力，它還能分泌在受損神經的恢復中起關鍵作用的神經營養因子，如神經生長因子、腦源性神經營養因子、睫狀神經營養因子、膠質細胞源性神經營養因子等［7］。幸存的SCs 和髓鞘能夠幫助引導新長出的神經支配目標組織［8］。Isaacman?Beck 等［9］通過在斑馬魚中使用活細胞成像技術，發現再生的運動軸突對原來的肌肉區域表現出強烈的偏好，并且軸突在選擇原路徑之前會廣泛地向各個方向探測正確的生長軌跡。這一過程中SCs 受損后賴氨酸羥化酶3（lysyl hydroxylase 3，LH3）的表達量增加可以恢復軸突靶向再生的能力。此外，在斷面附近的SCs 能夠表達LH3 底物膠原蛋白4a5（collagen 4a5，col4a5），在再生過程中col4a5 可能通過軸突導向抑制因子Slit1a 進行方向探測，使不適當的生長軌跡上的軸突退化，以達到選擇性再生的目的。

1.2 DPSCs 可向SCs 樣細胞誘導分化

DPSCs 是牙髓中的多能干細胞，可以通過分泌外泌體將信號分子傳遞給SCs 介導細胞間通訊［10］，且在特定神經誘導培養基上擴增良好，其具有神經分化能力可分化為SCs 樣細胞［11］。在神經基礎培養基中加入堿性成纖維細胞生長因子和表皮生長因子可誘導DPSCs 神經向分化［12］。Hei 等［11］采用整合素β4（CD104）、S?100 蛋白、層粘連蛋白（Laminin）、神經營養因子低親和力受體（low affini?ty neurotrophin receptor，p75NTR）免疫細胞化學方法對分化后的DPSCs 成功地進行了SCs 樣細胞的鑒定，且脈沖電磁場的應用更加促進了DPSCs 向SCs 樣細胞的分化。有研究顯示，磁性細胞分選方法分選出表達p75NTR、巢蛋白（Nestin）和SOX?10（SRY?related high?mobility?group（HMG）?box protein?10，SOX?10）的Stro?1+/cKit+/CD34+DPSCs，在體外具有分化為SCs 樣細胞的能力，與髓鞘分化相關并可在體內促進軸突再生。這一DPSCs 亞群容易獲得、體外增殖迅速、可成功地整合到宿主組織中，因此可能成為再生醫學的優秀候選者，特別是在神經組織工程領域［2］。

2 DPSCs 與SHED 在PNI 中的作用差異

DPSCs 缺乏主要組織相容性復合體Ⅱ類抗原的表達，免疫原性較低，能夠抑制同種異體反應的T 細胞增殖，不刺激免疫應答；也可以通過抑制促炎細胞因子的產生和刺激抗炎細胞因子、抗原特異性T 細胞的產生來減少體內的炎癥反應［13］。乳牙和恒牙的牙髓干細胞在周圍神經中的作用存在相似性，也存在一定的差異。

2.1 免疫調節

SHED 可通過分泌單核細胞趨化因子?1 調節巨噬細胞遷移和浸潤，表現出獨特的免疫調節特性，有助于組織修復［14］。DPSCs 通過減少小膠質細胞激活、下調炎性標志物離子鈣接頭蛋白分子1 和活性氧的積累、降低炎癥細胞因子的分泌，表現出較強的免疫調節和抗炎能力［15］。

2.2 抗炎作用

SHED 作用于巨噬細胞，上調CC 類趨化因子2和白血病抑制因子的表達，使巨噬細胞大量浸潤于損傷部位，將巨噬細胞表型從加速組織破壞的促炎M1 巨噬細胞轉化為促進組織修復的抗炎M2巨噬細胞［16］。DPSCs 表達的白細胞介素?10 具有抗炎活性，而且DPSCs 表達的巨噬細胞集落刺激因子高于粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，可誘導巨噬細胞M2 極化［17］，在一定程度上可緩解神經性疼痛和平衡神經損害，最終減少了周圍神經損傷后氧化應激和體內穩態調節異常所致的神經炎癥反應［15］。

2.3 神經標志物的表達

DPSC 和SHED 的神經向分化后可表達成熟的神經元標記物β?微管蛋白Ⅲ（β?Ⅲ?Tubulin）、GA?TA 結合蛋白3 等［18］，在幼稚狀態下也可自發表達早期神經元和神經嵴標記物Nestin 等［19］。基因芯片分析顯示，SHED 攜帶較高的八聚體結合轉錄因子?4（octamer?binding transcription factor?4，OCT4）、SOX2、Nanog 等胚胎標志基因［20］，促進成脂、成骨［21］；而DPSCs 攜帶較高的人類配對盒基因（paired?boxgene6，PAX6）、Nestin、β?Ⅲ?Tubulin 等神經源性基因［20］，有利于神經發生［21］。

2.4 血管生成

在神經損傷部位缺氧條件下SHED 可誘導巨噬細胞產生血管內皮生長因子?A（vascular endothe?lial growth factor?A，VEGF?A）增強了損傷部位新血管的形成，并使SCs 遷移促成Büngner 帶的形成［16］。DPSCs 本身具有較高的血管生成特性，也可分泌VEGF?A 刺激血管形成，分化為SCs 后仍保留其在內皮細胞的增殖、遷移和血管形成的能力［16］。

2.5 其他作用

SHED 在細胞生長動力學方面具有較高的增殖率，增長速度約為DPSCs 的兩倍，細胞集落形成特性、集落數量和大小均高于DPSCs［20］；而DPSCs比SHED 更好的聚集成神經球，顯示出更多地致力于神經元譜系的表達［20］。hDPSCs 具有肌生成潛力，可使營養不良骨骼肌的組織病理得到改善，可用于促進橫紋肌萎縮的再生［22］，也可提高糖尿病大鼠的坐骨神經傳導速度，使骨骼肌血管密度和神經纖維密度增加［23］。

DPSCs 和SHED 在PNI 修復過程有兩個潛在機制，即直接分化或融合后替換丟失的內源性細胞，以及間接分泌可溶性因子或外泌體介導對存活內源性細胞的支持，這兩種機制可能是單獨作用或協同作用［21］。

3 DPSCs 組織工程學修復PNI

自體神經移植是PNI 修復金標準，它提供了富含SCs 的結構來引導軸突再生，雖然免疫排斥反應會極低，但是會造成供體區域神經損傷，導致供區神經功能喪失［24］。研究者將DPSCs 與組織工程神經導管支架相結合，用于傳遞信號分子、生長因子、藥物等。

組織工程近年來逐漸成為研究的熱點內容之一，其主要目標是開發能夠治愈、修復或再生受傷病變組織和器官的生物材料替代品［25］。組織工程學將生物相容性材料（如聚四氟乙烯、硅樹脂、聚乙烯、膠原、生物聚合物等）與DPSCs、神經生長相關因子、血管生成相關因子等相結合為神經再生提供一個可控的、可選擇的、可改良的微環境［26］。有研究表明，SHED 同聚乙醇酸神經導管（polygly?colic acid tube，PGA）聯合應用不僅可促進面神經下頜支的再生，由于導管的存在還減少了受損組織之間的粘連［27］；多種材料的聯合應用比單一材料的使用存在更多的優勢，通過物理性吸附、共價鍵結合、混紡、同軸電紡等方式對支架進行加工修飾，可改善材料性能，使其更有利于神經修復。Lackington 等［28］用膠原涂層PGA 神經導管修復大鼠面神經缺損，結果表明帶涂層修飾比不帶修飾的導管修復效果好；Hu 等［29］將聚羥基丁酸戊酯和聚環氧乙烷按照9∶1 的質量比進行混合靜電紡得到三維的神經支架，用于神經再生實驗，證明后者的加入提高了干細胞與聚羥基丁酸戊酯的生物相容性。大量研究結果顯示聚合物的組合改變了導管的物理性質，也改變了它們的神經引導特性。DPSCs 同組織工程支架的聯合應用維持了受損神經解剖結構的完整，并提供了方向引導和空間支撐，但在神經導管提供的微環境中軸突再生的分子機制尚不清楚，DPSCs 在再生醫學和組織工程中的應用仍需要不斷的探索。

4 DPSCs 應用于PNI 修復過程中面臨的問題

近年來，研究者開始重視發展DPSCs 對PNI 的治療策略，以增強軸突再生、促進靶組織選擇性再生并調節周圍神經系統的重組［30］，但高質量的功能性恢復面臨的問題仍然很多，包括：①干細胞的選擇，在有良好適應證的年輕患者中選擇合適的健康牙齒，采用改進的干細胞分離、培養技術和神經誘導方案，使DPSCs 向著有利于神經分化的方向發展［31］，這一過程需要考慮干細胞的來源、采集方式、免疫原性、增殖效率［14］等因素［31］；②功能性鏈接的恢復，由于神經纖維化導致神經瘤的形成［32］、遠端軸突瓦勒變性的發生及目標組織的不可逆性萎縮［6］等問題的存在，使恢復神經的功能性鏈接成為一項難題；③軸突再生方向的不可控，神經橫斷傷破壞了神經和神經基底層的連續性，迫使再生軸突穿過無細胞環境、穿越損傷間隙，這一過程中再生的軸突向各個方向不斷發展，其方向具有不可控性［9］；④組織工程材料的選擇與應用，神經損傷后結締組織向缺損部位延伸［15］、粘連影響神經愈合，而組織工程學修復可以將周圍結締組織分離，保證神經修復空間［24］，但其尚在發展的初期，材料的選擇、技術的應用正在研究階段；⑤動物模型的局限，國內外實驗大部分都是建立在動物模型之上，其神經損傷模型表現出的再生潛力與人體不同，將其轉化到臨床應用于人體修復仍是一項嚴峻的挑戰；⑥修復機制仍不明確［33］。

5 總結與展望

DPSCs 不但可以分泌細胞因子作用于損傷后殘存的SCs，還具有誘導向SCs 樣細胞分化的潛力；DPSCs 與組織工程學聯合應用成為PNI 修復的新趨勢；然而其受患者的年齡、病變部位和類型、手術修復的時機和方式以及軸突再生跨越損傷的距離等多種因素影響。乳牙和恒牙的牙髓干細胞是存在于同一生物體不同時期的兩種DPSCs 細胞狀態，二者除了具有MSC 的基本特征外，還具有不同的生物學特性，它們的區別應用為神經修復提供了一個新的選擇。

【Author contributions】Xu XH wrote the article. Xu WQ and Yao LH revised the article. Wang XM reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.