LncRNA在固有免疫應答中的調控作用

寧曉縣 申元英 郭 樂

固有免疫主要由組織屏障、免疫細胞和免疫分子構成，是宿主消除入侵病原體的首道防線。免疫細胞表面具有模式識別受體(PRRs)，如Toll樣受體(toll-like receptors, TLRs)、維甲酸誘導基因I樣受體家族[retinoic-acid-inducible gene I(RIG-I)-like receptors, RLRs]和核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族[nucleotide-binding oligomerization domain(NOD)-like receptors, NLRs]，能識別結合病原體及其產物或體內凋亡、畸變等細胞表面相關配體，發揮抗感染、抗腫瘤、免疫調節作用，并參與適應性免疫應答的啟動、效應和調節。研究表明，人類基因組序列中能夠編碼蛋白質的核酸序列只有不到2%，其余大部分序列只能被轉錄為非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)，不具有編碼蛋白質的功能，這些ncRNA曾經一度被認為是沒有功能的“垃圾序列”和“轉錄噪聲”而未曾受到關注和重視。在20世紀90年代早期，具有基因特異性調控作用的LncRNA被發現，隨著研究的發展，LncRNA在基因的轉錄、翻譯等重要生命過程中的作用逐漸被探究[1]。

一、LncRNA概述

LncRNA是一大類非蛋白編碼轉錄本，長度超過200個核苷酸，位于細胞核或細胞質內，大部分LncRNA是由RNA聚合酶Ⅱ轉錄形成的，擁有3′ployA尾巴和5′帽子結構，由于缺少完整開放閱讀框，不能編碼蛋白質，而是直接作為RNA發揮作用。LncRNA根據蛋白質編碼基因的位置可以分為以下5種類型：①正義(sense)LncRNA；②反義(antisense)LncRNA；③內含子(intronic)LncRNA；④長基因間非編碼RNA(long intergenic non-coding RNAs, LincRNA)；⑤雙向LncRNA。研究表明，LncRNA可以參與多種細胞過程：染色質重塑、轉錄和翻譯調控、mRNA降解、剪接調控、細胞周期調控和固有免疫等[2]。隨著高通量測序技術的迅速發展和應用，發現LncRNA可以調控基因表達，主要通過調節細胞免疫、表觀遺傳、基因轉錄水平以及轉錄后水平發揮作用，進而參與多種疾病的發生機制，并在固有免疫應答中發揮重要的作用[3]。2009年，Guttman等提出LncRNA可能調節固有免疫應答的觀點，此后大量研究也發現許多(如LncRNA Lethe、LncRNA PACER、LncRNA THRIL和LncRNA NEAT1等)與固有免疫相關的LncRNA[4]。

二、LncRNA對TLRs信號通路的調控作用

TLRs是重要的模式識別受體，能夠識別來自病毒、細菌、真菌和寄生蟲原生動物的PAMPs，誘導產生炎性細胞因子或Ⅰ/Ⅲ型干擾素(interferon, IFN)，抵抗病原微生物感染，啟動固有免疫。目前，在哺乳動物中已鑒定出13種TLR，其中TLR1～TLR9在小鼠和人體內均表達，TLR10僅存在于人體內，而TLR11～TLR13僅在小鼠體內被發現。TLR2、TLR4、TLR5位于細胞膜表面，分別識別脂蛋白、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)以及鞭毛蛋白；TLR3、TLR7、TLR8和TLR9位于細胞內囊泡，參與識別微生物的核酸成分，分別識別病毒雙鏈核糖核酸(dsRNA)、單鏈核糖核酸(ssRNA)、ssRNA和CpG寡核苷酸(CpG DNA)。LncRNA是TLRs激活調節劑之一，可以靶向TLRs信號通路上的許多分子，如轉錄因子NF-κB、接頭蛋白MYD88、細胞因子IL-6、CCL2、CXCL10等。

1.LncRNA對TLR2、TLR4、TLR5信號通路的調控作用：TLR2能識別PAMPs及某些內源性配體，引發信號轉導并導致炎性介質的釋放，越來越多的證據表明，LncRNA參與調節TLR2介導的免疫反應。如LncRNA-Cox2是一種廣泛的調控元件，能激活和抑制不同種類免疫基因。在TLR2配體Pam3CSK4的刺激下，巨噬細胞(macrophages, Mφ)中LncRNA-Cox2過度表達，通過與hnRNP-A/B和hnRNP-A2/B1形成復合物以抑制炎癥靶基因轉錄，導致促炎基因的表達增加[3]。此外，有實驗通過利用反義寡核苷酸沉默THP-1細胞中LncRNA NEAT1的表達，發現TLR2信號活化下游誘導的細胞因子(如IL-6、CCL2、CXCL10等)受到抑制，從而阻止炎癥發生[5]。然而，LncRNA-DYNLRB2-2對TLR2的表達起負調控作用，在Mφ中，LncRNA-DYNLRB2-2表達上調，通過降低TLR2的表達，促進膽固醇流出，最終減輕炎性反應[6]。由此可見，LncRNA可以作為Mφ中的TLR2信號通路的調控因子參與疾病的進展。

TLR4是LPS刺激下革蘭陰性菌的主要PRRs，研究發現,LncRNA可以靶向TLR4，調控炎性反應。LncRNA-EPS是一種免疫調節LncRNA，在Mφ中受到精確調控，控制IRGs(免疫反應基因)的表達，其通過TLR4誘導位于其3′末端CANACA基序與異質核核糖核蛋白L(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L, hnRNPL)相互作用，控制核小體的定位并抑制免疫基因轉錄，從而抑制炎性反應[7]。Tao等[8]通過采集感染呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)的患者的鼻咽樣本并結合體外細胞實驗發現，LncRNA MEG3可以抑制TLR4依賴的p38 MAPK和NF-κB信號通路，保護人氣道上皮細胞免受RSV感染，從而抑制炎性反應。LncRNA HIX003209是另一個調節TLR4的LncRNA，在類風濕關節炎中與疾病活動呈正相關，但不直接與TLR2、TLR4及下游蛋白NF-κB結合，而是通過特異性識別miR-6089，發揮內源競爭RNA(ceRNA)的作用，間接促進Mφ中TLR4的表達和下游信號分子NF-κB的激活，從而增強炎性反應[9]。

TLR5是最常觸發的模式識別受體，多種LncRNA被證明間接參與TLR5信號通路的調控。其中，LncRNA MALAT1在調節炎癥和固有免疫中具有潛在作用，在燒傷和燒傷后感染敗血癥的動物模型中，觀察到MALAT1表達明顯增加，miR-214表達降低，其靶基因TLR5表達與MALAT1的結果相同，而shMALAT1處理會逆轉這些表達，提示MALAT1可以間接調控TLR5，在敗血癥中發揮關鍵作用[10]。研究表明，在神經性疼痛中，XIST/miR-154-5p/TLR5是一個新的治療靶點，LncRNA XIST可以通過降低miR-154-5p的產生來顯著上調TLR5的表達，從而促進神經病理性疼痛的發生和進展[11]。此外，在體內小鼠模型和體外癲癇細胞模型中，轉錄因子SP1可以激活LncRNA SNHG1的轉錄活性，被激活的SNHG1負調控miR-154-5p，靶向TLR5發揮功能，促進癲癇的發展[12]。

2.LncRNA對TLR3、TLR7、TLR8、TLR9信號通路的調控作用：TLR3能特異性識別dsRNA，通過激活NF-κB或干擾素調節因子3(interferon regulatory factor 3, IRF3)，從而發揮免疫作用。有研究發現，LncRNA CRNDE可以調節TLR3/NF-κB信號通路，通過激活TLR3信號通路，進一步激活NF-κB，釋放IL-6、CCL5、CXCL9、TNFSF10等多種細胞因子，觸發炎性反應，最終誘導膿毒癥導致的腎損傷(kidney injury, KI)以及腫瘤的發生和發展[13,14]。

LncRNA MEG3參與Hunner型間質性膀胱炎(hunner-type interstitial cystitis, HIC)的發病機制，其水平的升高可以作為預測HIC風險升高的指標。通過采集HIC患者尿液樣本進行實時聚合酶鏈反應和蛋白免疫印跡實驗，證明LncRNA MEG3通過抑制miR-19a-3p，增高TLR7的表達，從而導致炎癥損傷[15]。Li等[16]研究證實，外泌體LncRNA FMR1-AS1可以和TLR7結合，激活TLR7/NF-κB信號，促進c-Myc表達，誘導食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)細胞增殖、抗凋亡和侵襲能力，最終促進ESCC的發展。

TLR8被證實可以通過激活NF-κB，參與調節癌癥。其中，LncRNA TLR8-AS1是卵巢癌中與癌癥相關的成纖維細胞調控LncRNA，其作為一種致癌基因，通過穩定TLR8 mRNA上調TLR8，從而激活NF-κB信號通路，最終促進卵巢癌的進展[17]。

TLR9在免疫細胞中高表達。研究發現，Lnc-DC是樹突狀細胞(dendritic cell, DC)中的一組特定LncRNA，通過調控TLR9/STAT3信號通路，介導DC的生長、凋亡和免疫反應，敲低Lnc-DC，細胞凋亡增加，并負調節免疫應答[18]。此外，腺病毒感染可能觸發TLR9-MYD88-STAT3信號，上調LncRNA-NEAT1的表達并激活STAT3，激活的STAT3進一步上調NEAT1，形成正反饋回路，促進原代膠質瘤細胞形成膠質瘤干細胞(glioma stem cells，GSCs)，導致癌癥的復發和轉移[19]。

綜上所述，多種LncRNA通過TLRs信號通路調控固有免疫，參與炎性反應的激活、消退以及腫瘤和其他許多疾病的發生、發展，為相關疾病的治療提供新的方向。

三、LncRNA對NLRs信號通路的調控作用

NLR簡稱NOD受體，屬于胞漿性PRR，是細胞內蛋白質，主要在炎性反應和宿主抵抗微生物病原體的防御中發揮關鍵功能。除NOD1和NOD2，其他NLR(如NLRP3)可以在炎性小體的組裝以及活化過程中發揮作用，控制半胱天冬酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase, caspase-1)的活化，調節IL-1β和IL-18的產生，對于觸發炎癥及啟動宿主防御反應極為重要[20]。NOD受體中的NLRP3和NLRC5在固有免疫應答中起著關鍵作用，LncRNA作為調節分子，可以調節NLRP3的激活以及其引起的細胞因子的產生，還可以作為ceRNA與miRNA相互作用，靶向調控NLRC5，從而在疾病的發生過程中發揮重要作用。

1.LncRNA對NLRP3信號通路的調控作用：NLRP3炎性小體是固有免疫的重要組分，在機體免疫反應和疾病發生過程中具有重要作用。研究表明，LncRNA可以調控NLRP3的表達，介導IL-1β和IL-18的分泌，從而參與調控疾病。其中，LncRNA-Cox2能夠激活和抑制固有免疫細胞中的免疫基因，通過結合NF-κB的亞基p65，促進其核易位和轉錄，調節炎性小體傳感器NLRP3和凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)的表達。研究發現，敲除LncRNA-Cox2，會降低LPS刺激后的NLRP3和ASC，阻止caspase-1激活，導致IL-1β分泌減少，并使β干擾素TIR結構域銜接蛋白(TIR-domain containing adaptor inducing interferon-β, TRIF)裂解減弱，從而增強TRIF介導的自噬，限制炎癥體的活性，減輕炎性反應[20]。研究證實，在乳腺炎中，Lnc XIST產生負反饋回路，阻止NF-κB通路激活，減少NLRP3的產生，抑制IL-1β和IL-18的分泌，促進細胞增殖，維持細胞活力，減緩細胞凋亡[21]。

2.LncRNA對NLRC5信號通路的調控作用：NLRC5是NLR蛋白家族中最大的蛋白分子，被確定為免疫反應的關鍵調節劑，在免疫應答調節和細胞因子中發揮著重要作用，并參與多種人類腫瘤的進展。在神經膠質瘤中，LncRNA SCAMP1表達上調，并作為致癌基因發揮作用，通過探究其機制發現LncRNA SCAMP1可以負調控miR-499a-5p的表達，增加轉錄因子LMX1A，轉錄激活NLRC5的表達，通過刺激Wnt/β-catenin信號通路促進膠質瘤細胞的惡性進展[22]。實驗發現，LncRNA XIST是一種新的乳腺癌預測因子，在乳腺癌組織和細胞中XIST顯著上調，競爭性結合miR-125b-5p或miR-7/miR-92b，靶向抑制NLRC5，導致乳腺癌細胞惡性化[23,24]。

四、LncRNA對RLRs信號通路的調控作用

RLRs是一種重要的病原體識別受體，包括視黃酸誘導基因I(RIG-I)、黑素瘤分化相關因子5(melanoma differentiation-associated gene 5, MDA5)、遺傳學和生理學實驗室蛋白2(laboratory of genetics and physiology 2, LGP2)。其中RIG-I和MDA5通過共同的銜接子IPS-1信號驅動下游轉錄反應的激活，誘導IFN的產生，增加抗病毒和免疫調節基因的表達，控制病毒復制和傳播，并引起細胞內的免疫應答[25，26]。

1.LncRNA對RIG-I信號通路的調控作用：RIG-I信號通路是抗病毒免疫反應中的新型負調控機制，通過使用水皰性口炎病毒感染進行研究，證實Lnc-MxA作為干擾素刺激基因，可以和IFN-β啟動子形成RNA-DNA三鏈體，干擾IRF3和NF-κB與啟動子的結合，負調控IFN-β的轉錄，抑制RIG-I介導的抗病毒免疫反應[27]。Lnc-Lsm3b是一種宿主來源、IFN誘導的長非編碼RNA，可以維持免疫穩態，出現病毒感染時能與RIG-I特異性結合。在MφRAW264.7中研究其機制發現，Lnc-Lsm3b通過反饋抑制RIG-I激活，并阻止IFN的過量生產，控制自身免疫性炎性疾病[25]。

2.LncRNA對MDA5信號通路的調控作用：LncRNA ITPRIP-1是首個被發現參與MDA5激活的LncRNA，由IFN和病毒感染誘導。在病毒感染的免疫反應中，ITPRIP-1不通過RIG-I信號通路，而是通過促進MDA5對病毒RNA的識別和MDA5介導的IFN產生信號轉導，增強MDA5介導的固有免疫反應[26]。目前，LncRNA參與MDA5信號通路調控的研究報道有限，還有待于進一步研究。

五、展 望

固有免疫是機體抗感染的第一道防線，可啟動適應性免疫應答，通過PRRs調控免疫反應，以維持機體的穩態。多種LncRNA被證實可以通過調節靶基因的表達、調控固有免疫信號通路，對外界刺激做出快速應答。相對于miRNA以及編碼蛋白的序列來說，LncRNA的研究還處于初期階段，關于LncRNA對固有免疫受體的精確調控機制的研究還有待深入。隨著對LncRNA領域的不斷深入研究，其與固有免疫受體信號轉導之間的關系以及機制將會逐步清晰明了，從而為相關疾病的治療和預后提供新靶點。