原發性干燥綜合征與未折疊蛋白反應

金 潔 侯佳奇 薛 鸞

原發性干燥綜合征(primary sj?gren′s syndrome，pSS)是一種主要侵犯外分泌腺的慢性自身免疫性疾病，外分泌腺體的上皮細胞是免疫炎癥的主要表現部位，所以pSS又叫自身免疫性外分泌腺體上皮細胞炎。在我國，該疾病的發生率為0.33%～0.77%，女性患者多見，發病年齡在50歲左右，是發生率最高的自身免疫病之一，僅次于類風濕性關節炎[1]。因唾液腺和淚腺受損，臨床上常常表現出口干、眼干等癥狀，也有其他外分泌腺體及腺體外器官受累導致多系統的損害，比如腎臟、血管、肌肉、神經等受累，大約5%的患者可發生淋巴細胞性惡性腫瘤[2]。

pSS的發病機制尚不明確，主要認為與遺傳、環境和免疫異常等因素相關。這些因素刺激固有免疫細胞和腺上皮，可導致T、B淋巴細胞浸潤、增殖、分化，促進炎癥的發生，并且可以導致免疫復合物的產生，從而最終造成外分泌腺和腺體外器官的損害。pSS目前尚無根治方法，改善癥狀、延緩器官損害為主要治療目的，針對口干、眼干等干燥癥狀，常使用人工淚液、促分泌素等，針對存在高球蛋白血癥或腺體外損害的患者，常使用糖皮質激素、羥氯喹、硫唑嘌呤等免疫抑制劑治療，但目前仍無循證醫學依據的有效藥物。近年來生物制劑治療pSS也越來越具有前景，針對B淋巴細胞的靶向治療也成為研究熱點，需要大規模的實驗證實靶向藥物的有效性。除此之外，中藥的臨床實踐證明其可以整體改善pSS的干燥、乏力、疼痛等癥狀，并有一定的免疫調節作用。目前pSS的發病機制尚未完全明確，治療方法多為緩解癥狀的對癥治療，缺乏循證醫學依據，仍然需要不停地探索、實驗。

近年來，內質網應激在癌癥、代謝性疾病、自身免疫病等多種疾病中發揮調控作用，愈發受到關注。在類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、系統性硬化癥等自身免疫性疾病中均發現了抗內質網伴侶抗體，說明自身免疫性疾病中的內質網過度應激[3]。pSS的治療多為對癥治療，探索內質網應激在pSS中的作用不僅可以進一步研究pSS發病機制，甚至也可以為pSS的治療提供新的靶點。

一、上皮細胞在 pSS 的作用

有研究認為pSS本質上就是一種上皮細胞炎，上皮細胞在pSS中不僅是自身免疫的靶點，并且參與了疾病的病理過程，其通過調節鄰近唾液腺導管的浸潤性淋巴細胞的位置，幫助維持以及促進淋巴細胞滯留和存活的環境。各種上皮組織的浸潤性病變的發生，以及患者組織病變中幾種炎性蛋白在上皮中的表達增加，都表明上皮細胞在pSS的發病中起著重要的作用[4]。在pSS中，外分泌腺為主要靶點，然而臨床和病理研究表明，自身反應性免疫細胞不僅包圍和攻擊外分泌腺的上皮細胞，而且還包圍和攻擊支氣管、腎上皮和膽管周圍的上皮細胞，上皮細胞在干燥綜合征的發病中如抗原遞呈、細胞凋亡、趨化因子產生起著非常重要的作用[5]。

pSS的主要靶器官是外分泌腺，尤其是唾液腺，患者唾液產量的減少與上皮周圍免疫細胞的持續積累和腺體結構的逐漸破壞有關。唾液腺上皮細胞(salivary gland epithelial cells, SGECs)作為一種非專業性抗原遞呈細胞顯示幾種高水平的免疫活性分子，可以介導淋巴細胞歸巢、抗原遞呈和放大上皮與免疫細胞的相互作用。SGECs會分泌幾種趨化因子CXCL9、CXCL10、 CXCL12、CXCL13、CCL19和CCL21,可以促進各種炎性淋巴細胞群體的早期吸引[6]。黏附分子如細胞間黏附分子(ICAM)-1和血管細胞黏附分子(VCAM)-1在唾液腺上皮細胞的表達，使SGECs這種非專業性抗原遞呈細胞與T淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA1)和極晚期活化抗原-4(VLA4)結合，SGECs和T細胞之間突觸的穩定，有助于介導這些細胞在炎癥或病理性損傷部位的滯留。SGECs還會分泌如IL-1、IL-6、TNF-α等促炎性細胞因子，也可以通過上調MHCⅡ和共刺激分子CD40、CD80、CD86來響應促炎性細胞因子[4]。這些因素共同造成了炎癥環境，調節組織內的炎癥過程。

二、UPR參與pSS發病

1.內質網：內質網是細胞中重要的細胞器，由蛋白質和脂類構成，是由生物膜構成的互相通連的片層隙狀或小管狀系統。其膜性管道系統是細胞內物質運輸的通路，也是蛋白質翻譯修飾的重要場所，并且可以為細胞內的酶反應提供充足的反應面積[7]。內質網的生理機制十分復雜，其正常的生理功能包括蛋白質的合成、鈣離子儲備相關信號轉導、蛋白質的分泌等過程[8]。內質網包括粗糙型內質網和光滑型內質網，粗糙型內質網的膜上含有核糖體，光滑型內質網的膜上無核糖體。而粗糙型內質網可促進蛋白質合成，并將其運送到生物體內發揮作用的地方，光滑型內質網參加以及調節糖類、脂類的合成，并與蛋白質運輸以及生化反應有緊密的聯系[9]。內質網中通常包含許多分子伴侶如熱休克蛋白、凝集素等和折疊酶如蛋白質二硫鍵異構酶、內質網蛋白57(endoplasmic reticulum protein, ERp57)，它們維持內質網中蛋白質折疊的能力，質量控制系統識別錯誤折疊的蛋白質，通過內質網相關蛋白降解(endoplasmic reticulum associated degradation, ERAD)、自噬等途徑改變蛋白質合成和轉運到內質網的速率，蛋白質折疊、成熟和質量控制，蛋白質運輸和消除錯誤折疊的蛋白質，從而將正確的蛋白質輸送到各種細胞器、細胞表面或進入細胞外空間[10]。當蛋白質的加工產生問題時，則會導致錯誤折疊的蛋白質在內質網中積聚，產生缺氧、蛋白質超載、鈣代謝紊亂、細胞內ATP水平降低和氧化應激等反應。當蛋白質聚集超過負荷時，則會導致內質網異常。

2.pSS上皮細胞存在UPR：分泌細胞的一個共同特征是擴展的內質網，SGECs的腺泡和導管細胞新陳代謝活躍，是內質網伸展最廣的細胞之一，它們可以不斷產生唾液，唾液是一種富含蛋白質的液體。唾液成分首先在粗糙型內質網中合成，然后在粗糙型內質網和高爾基復合體中加工，在高爾基復合體中集中和靶向，并儲存在分泌顆粒中[11]。除此之外，在pSS的其他免疫系統作用的分泌細胞中，如淚腺、細支氣管、膽管和腎小管的上皮細胞也同樣存在延伸的內質網。內質網是真核生物體內感受外界變化極其敏感的生物感受器，內質網管腔內的蛋白質折疊過程容易受到各種生理和病理因素的干擾。當SGECs受到損傷或者處于炎癥環境中時，長期的刺激觸發細胞產生更多的蛋白質，內質網和鈣穩態就會受到破壞，干擾這些過程所需的能量，內質網系統就會產生壓力[12]。

在穩定狀態時，正常的細胞中，大約1/3在內質網中生成的蛋白質會產生錯誤的蛋白質折疊，當細胞受損或者處于壓力條件下時，便會誘發內質網產生應激，此時蛋白質錯誤折疊率和未折疊率升高，細胞為恢復正常的生理功能，保持內質網的穩態，便會激活相關凋亡通路，誘導細胞凋亡，產生UPR[13]。UPR是一個復雜的細胞內信號通路集合，這些信號通路已經進化為可以通過降低蛋白的錯誤折疊以及非折疊蛋白在內質網中的表達數量來促進蛋白質的正確折疊，從而在應激的早期使內質網功能保持正常的生理平衡狀態。除此之外，內質網管腔中擁有高水平的伴侶蛋白，可以阻止錯誤折疊或未折疊的蛋白。葡萄糖調節蛋白78(GRP78)是最重要及含量最豐富的內質網伴侶蛋白之一，也叫結合免疫球蛋白(Bip)，屬于熱休克蛋白70家族(Hsp70)，其參與了許多細胞過程，包括將新合成的多肽轉移到內質網膜上，促進新合成的蛋白質的折疊和組裝，維持新的蛋白質處于能夠隨后折疊和寡聚的狀態，調節DNA損傷以及調節鈣離子的穩態[14～16]。除了在新合成的蛋白質中發揮作用，GRP78還負責在蛋白質轉位過程中維持內質網的通透性屏障，靶向錯誤折疊的蛋白質進行逆行轉位，使它們能夠被蛋白酶體降解，促進內質網鈣儲存，以及感知該細胞器中的應激條件以激活UPR。GRP78/BIP與特定的內質網定位的DnaJ(ERdjs)家族蛋白的相互作用，刺激GRP78/BIP依賴ATP的底物相互作用，幾個ERdjs 也直接與未折疊的蛋白結合[17]。

UPR最初是為了恢復蛋白質的穩態和生理功能。然而，當恢復蛋白質穩定的一系列嘗試失敗或者內質網應激沒有減弱時，壓力持續時間過長或細胞損傷過于嚴重，UPR信號通常切換到促凋亡模式，致使凋亡信號的持續表達，動態平衡不能恢復，則最終可以引起細胞凋亡，導致細胞的死亡和代謝紊亂。UPR相關分子表達的改變可以幫助自身免疫病的啟動，UPR和炎癥信號的交互作用是內質網應激與免疫反應關聯的重點，實質細胞內的內質網穩態的紊亂可以觸發和增強炎性反應，UPR 3種信號通路均可激活NF-κB，參與促炎性細胞因子的表達，加速應激誘導的細胞凋亡，導致細胞死亡，損害pSS的靶器官。Moustaka 等[18]研究發現，通過電子顯微鏡觀察到pSS患者的SGECs內質網廣泛地擴張，內質網的廣泛擴張是內質網應激的明確標志，揭示了pSS靶組織的一個主要細胞器受到嚴重干擾。然而，目前內質網應激對自身免疫性疾病影響的了解及研究較少，UPR如何參與到pSS的發病需要更多的探索。

三、UPR激活信號通路

UPR激活3條信號通路，即蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase RNA-like ER kinase, PERK)、 肌酸需求酶1(inositol-requiring enzyme 1, IRE1)和轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。

1.PERK 信號通路：PERK是一種Ⅰ型內質網跨膜蛋白激酶，能抑制內質網中普遍的蛋白翻譯。正常情況下，PERK與內質網伴侶蛋白GRP78/Bip 結合，是處于一個非活性狀態。在哺乳動物中，內質網伴侶蛋白GRP78/Bip是激活3個主要傳感器的基礎。當內質網應激發生時，內質網伴侶蛋白GRP78/Bip與 PERK 解離，此時通過低聚和反式自磷酸化，PERK信號通路被激活，磷酸化的PERK可夠使翻譯起始因子eIF2α發生磷酸化，使細胞多數蛋白質的合成終止，進而調節細胞周期，減輕內質網負荷。PERK、eIF2α磷酸化同時激活ATF4，上調 ATF4的表達，ATF4可以參與氨基酸代謝、抗氧化反應、誘導凋亡、調控自噬等，可以上調凋亡蛋白CHOP的表達。CHOP是內質網應激的一個特定轉錄因子，在哺乳動物細胞中，CHOP 處于普遍表達的狀態，是內質網壓力介導細胞凋亡的主要信號分子[19～21]。ATF4、CHOP的mRNA和蛋白質的半衰期比較短，只有強烈而且長時間的PERK激活才會增加CHOP的穩態水平，因此只有過度的內質網應激才會保持持續的壓力，從而促進UPR的末端CHOP的持續表達，持續的CHOP表達通過增加促凋亡基因Bax的表達，降低抗凋亡基因Bcl-2的表達，引起細胞死亡。有研究發現，在pSS患者的唇腺組織研究中，與對照組比較，p-PERK/PERK比值、ATF4的表達均升高，表明UPR的PERK信號通路在唾液腺組織中激活[22]。

2.IRE1信號通路：IRE1α是廣泛表達的Ⅰ型跨膜蛋白，其胞質表面是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶以及處理編碼XBP1mRNA的核糖核酸內切酶(RNase)結構域，存在于內質網膜上。正常情況下，IRE1與內質網伴侶蛋白GRP78/Bip結合在內質網內腔。當內質網應激發生時，IRE1α的N端和Bip分離，隨后形成同源二聚體，通過寡聚和自身的磷酸化，導致RNase結構域的構象改變，從而使其激活。在X-box結合蛋白1(XBP1)mRNA中，RNase結構域催化非常規剪接，產生另一個羧基末端翻譯蛋白質中的結構域XBP1s，XBP1s是一個亮氨酸拉鏈系列轉錄因子，可控制編碼因子的表達，促進UPR涉及的許多基因的轉錄，包括提高蛋白質折疊能力的伴侶蛋白和ERAD涉及的蛋白，從而產生調節蛋白質折疊、分泌、ERAD、蛋白質轉位到內質網以及脂質合成的功能。XBP1也被證明在炎癥和自身免疫性疾病的Th17細胞分化中起作用[23]。此外，IRE1α可能參與了一個混雜的核糖核酸降解過程，稱為受調節的IRE1依賴性衰變，針對內質網定位的核糖核酸、核糖體核糖核酸和微小核糖核酸[24]。越來越多的證據表明，除了加工XBP1 mRNA外，IRE1還直接或間接地促進了與粗糙ER相關的一部分mRNA的快速裂解和破壞，從而減少了新蛋白進入ER內腔的過程。在信號傳遞中IRE1也起直接作用,活性磷酸化的IRE1與腫瘤壞死因子受體相關因子2(TRAF2)相互作用，隨后可以促進JUN N末端激酶(JNK)的激活,產生細胞凋亡信號，以及NF-κB信號，產生炎癥信號[25]。有實驗發現，在自身免疫性疾病系統性紅斑狼瘡中，與健康對照組比較，患者 XBP1基因的表達顯著上調，證明IRE1信號通路參與其發病機制中[26]。

3.ATF6信號通路：ATF6屬于內質網膜上的Ⅱ型跨膜蛋白，其N端含有堿性亮氨酸拉鏈的轉錄激活功能域，有轉錄、激活的功能，C端位于內質網腔內，具有BIP結合位點和高爾基體定位信號，可以感應內質網應激[27]。當內質網應激發生時，蛋白質的錯誤折疊率增高，ATF6移位到高爾基體上，并被Site-1和Site-2蛋白酶切割，釋放其細胞質尾部中包含的ATF6(N)轉錄因子。與XBP1一起，ATF6(N)增加了目標的轉錄，從而擴大了內質網的大小，增加了其蛋白質折疊能力，緩和內質網的壓力[28]。研究表明，在pSS患者的活檢組織中，觀察到ATF6α信號通路活性增加，如ATF6f切割片段的產生，以及ERAD機械部件(如EDEM1、p97、SEL1L、gp78、UBE2J1、UBE2G2、HERP和DERLIN1)的表達增加[22]。

四、展 望

唾液腺上皮細胞是pSS的重要靶點，也可能參與疾病發展的病理過程。在上皮細胞中，當細胞遭受損傷或者炎癥持續存在時，會出現持續的內質網應激中的UPR反應。UPR作為一種復雜的信號通路擁有雙面性，在細胞的發育、分化、功能和存活中有著重要作用，可產生積極作用維持細胞穩態，保護細胞功能，反之也有可能對細胞造成不可逆的損傷。所以，UPR可能是調節pSS中內質網應激及其重要治療的靶點。雖然目前內質網應激的作用機制不完全明確，對pSS中的UPR 反應的研究較少，但是相信在未來， UPR參與pSS唾液腺上皮細胞受損的具體機制會有更多、更全面的研究。有利于了解生物體如何面對壓力，也可能為pSS的治療提供新的靶點，改善pSS目前的治療局面。