改善骨組織工程支架抗菌性的研究進展

鄭劍瑩 韓 冰

骨移植手術(shù)常被用來治療骨創(chuàng)傷、骨腫瘤和遺傳異常等骨疾病。然而,大約10%的骨科手術(shù)患者會受到細菌感染[1]。大多數(shù)植入物相關(guān)感染是由葡萄球菌引起的,其中2/3的感染來源于金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌,它們是骨科生物材料相關(guān)感染的主要致病因子,對骨和周圍軟組織造成不利影響[2]。大腸桿菌也可引起與植入材料相關(guān)的多種感染[3]。因此,開發(fā)具有抗菌活性和骨再生潛力的骨移植材料已成為一個急需解決的臨床問題。本文主要介紹了關(guān)于改善骨組織工程支架材料抗菌性的研究進展,以期為未來的基礎(chǔ)和臨床研究提供可取信息。

一、支架與抗菌材料復(fù)合

1.與氧化石墨烯(graphene oxide,GO)復(fù)合:石墨烯能通過破壞大腸桿菌細胞膜的完整性殺滅大腸桿菌[4]。Wang等[5]制備了膠原蛋白/納米羥基磷灰石/氧化石墨烯復(fù)合材料。研究表明，GO粉末與復(fù)合材料均能抑制金黃色葡萄球菌生長,且在一定范圍內(nèi),材料的抑菌性隨GO含量的增加而提高。復(fù)合材料的抑菌原理可歸因于材料阻礙營養(yǎng)物質(zhì)進入細菌細胞或產(chǎn)生氧化應(yīng)激。因此,可通過提高材料表面粗糙度以增強材料的抑菌能力。此外,MTT實驗證實該復(fù)合材料具有良好的生物相容性。

2.與過氧化鈣復(fù)合:Maria等[3]采用由60%羥基磷灰石和40%β-磷酸三鈣組成的雙相磷酸鈣粉末制備生物陶瓷支架,將過氧化鈣(calcium peroxide,CPO)作為一種產(chǎn)氧抗菌生物材料與聚己內(nèi)酯溶液混合,采用浸漬涂覆法將其涂覆在支架上。研究表明，CPO能有效抑制細菌生長,其反應(yīng)產(chǎn)物(氫氧化鈣、過氧化氫和氧氣)起到殺菌劑的作用。此外,涂層中的疏水性聚己內(nèi)酯降低了CPO的釋放速率,避免了突釋的細胞毒性。然而,由于聚己內(nèi)酯的降解率較低,CPO粉末沒有足夠的時間釋放并殺滅細菌。所以,CPO涂層支架的抗菌活性具有時間依賴性。

3.與二氧化鈦復(fù)合:二氧化鈦由于其光催化性能具有固有的抗菌活性[6]。Cijun等[7]將納米二氧化鈦(nano titanium dioxiden,TiO2)摻入聚醚醚酮/聚乙二醇酸(polyetheretherketone/polyglycolicacid,PEEK/PGA)共混物構(gòu)建了PEEK/PGA-nTiO2抗菌支架。研究表明，含nTiO2的支架具有有效的抗菌活性,其抗菌活性隨nTiO2含量的增加而升高,當nTiO2含量達5%質(zhì)量分數(shù)時,支架的抗菌活性最強,之后下降。nTiO2可能的抗菌機制總結(jié)為:nTiO2可與水和氧氣反應(yīng)產(chǎn)生活性氧(active oxygen species,ROS),當ROS濃度超過細菌抗氧化防御系統(tǒng)的清除活性時,ROS會使細菌產(chǎn)生氧化應(yīng)激,進而損害細菌的結(jié)構(gòu)和功能。此外,TiO2與細菌細胞壁之間的接觸作用會產(chǎn)生機械應(yīng)力,導(dǎo)致細菌細胞膜變形。然后,nTiO2被吸收到細菌中,并從內(nèi)部破壞細菌。

4.與抗菌金屬離子復(fù)合

(1)銀離子(Ag+):Ag+不僅具有廣泛的抗菌活性,而且具有極小的細菌耐藥性。既往文獻表明,如果濃度合適,銀納米粒子(Ag nanopartic-les,AgNPs)的細胞毒性較低[8]。AgNPs的抗菌機制為Ag與細菌的肽聚糖細胞壁相互作用,導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,增加膜通透性。AgNPs與暴露的細菌蛋白巰基相互作用,防止DNA復(fù)制。AgNPs可附著在細菌細胞膜上,也可滲透到細菌內(nèi)部,通過與細菌含磷和含硫化合物如DNA相互作用而造成損傷,最后導(dǎo)致細菌死亡[9]。Smita等[2]制備了含有原位合成銀納米粒子的絲素蛋白薄膜,研究證明其具有較好的抗菌性能,對固著和浮游的金黃色葡萄球菌的生長和具有抗藥性的大腸桿菌生物膜的形成具有抑制作用,且支持hMSCs細胞的生長和增殖,不破壞hMSCs細胞的成骨分化。然而,最近一項研究表明,最初易受AgNPs影響的細菌如果長期暴露于AgNPs的亞抑制濃度會產(chǎn)生抗藥性,其原因是細菌鞭毛蛋白對AgNPs產(chǎn)生聚集作用,從而抑制其對革蘭陰性菌的抗菌作用[10]。聚集的AgNPs比分散良好的AgNPs具有更低的抗菌活性。Smita等[2]制成的絲膜含有分散良好的AgNPs,這些都是由絲素蛋白所穩(wěn)定的。此外,由于在薄膜干燥過程中AgNPs被物理包裹到絲素結(jié)構(gòu)中,這些AgNPs無法聚集,因此革蘭陰性菌的抗藥機制在這些薄膜中是無效的。所以,制備含有原位合成銀納米粒子的抗菌絲素薄膜是控制細菌生長和解決抗藥性更好的方法。

(2)銅離子:Azeena等[11]制備了摻銅的硅灰石顆粒,證實在硅灰石中加入銅增強了材料對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用。金屬銅表面與微生物的DNA分子結(jié)合會導(dǎo)致DNA復(fù)制受到抑制。此外,銅也可與促進細菌生長的巰基結(jié)合。生長抑制也可能是由于細菌細胞呼吸被抑制而發(fā)生的,從而使ROS的產(chǎn)生上調(diào),導(dǎo)致細菌停止生長。

(3)鋅離子(Zn2+)、鎂離子(Mg2+):Zn2+具有抗菌和抗炎作用,對骨形成有刺激作用,支架中鋅離子的釋放會引起糖酵解、跨膜質(zhì)子易位和耐酸等多種細菌活性被抑制,從而導(dǎo)致細菌被破壞[12]。此外,鎂離子的釋放會改變培養(yǎng)基的堿性,并在細菌細胞中產(chǎn)生高滲透壓,導(dǎo)致細菌失活[13]。Zamani等[14]將含有鋅和鎂的生物活性玻璃顆粒、海藻酸鈉與氯化鈣復(fù)合制成支架。研究表明，含鋅和鎂的生物活性玻璃在增強支架的抗菌效果中起關(guān)鍵作用,由于復(fù)合支架中Zn2+和Mg2+的釋放,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長受到了明顯抑制。

(4)鈷離子:氧化鈷納米粉末通過產(chǎn)生ROS有效抑制大腸桿菌的生長[15]。Lin等[16]制備了含有20%質(zhì)量分數(shù)鈷取代羥基磷灰石粉末的聚己內(nèi)酯復(fù)合膜。研究表明，鈷取代羥基磷灰石粉末的加入使聚己內(nèi)酯膜對大腸桿菌具有良好的抗菌作用。同時,該復(fù)合膜通過持續(xù)釋放鈷離子有效減少自由基的產(chǎn)生,進而減少炎性反應(yīng)的發(fā)生。此外,MTT實驗證明復(fù)合膜是無毒的,不會對身體產(chǎn)生負面影響。

(5)鈰離子(Ce3+)、鍶離子(Sr2+):Sundarabha-rathi等[17]研制出Ce3+-Sr2+共摻雜納米羥基磷灰石支架。研究結(jié)果顯示，其對金黃色葡萄球菌和和銅綠假單胞菌均具有抗菌活性。

5.與生物活性物質(zhì)復(fù)合

(1)龍眼籽粗提取物(crude water extract oflongan seed,WLS):WLS中的酚類化合物具有較強的抗菌活性。Pankongadisak等[18]制備出含不同質(zhì)量分數(shù)絲素蛋白的殼聚糖/絲素蛋白水凝膠,并負載WLS以改變水凝膠的抗菌性。實驗結(jié)果表明，負載WLS的水凝膠相比不含WLS的水凝膠對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有更好的抗菌活性。

(2)胡蘆巴種子多糖(trigonella foenum gra-ecum seed polysaccharide,TFSP):Zia等[19]制備了納米羥基磷灰石(nano-hydroxyapatite,nHA)、殼聚糖(chitosan,CS)和胡蘆巴種子多糖(TFSP)三組分生物活性納米復(fù)合材料。研究表明，TFSP的加入提高了nHA-CS納米復(fù)合材料對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性。

(3)槲皮素:槲皮素是一種延緩氧化損傷,使細胞免于死亡的黃酮類化合物,對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有很高的抗菌活性。Soraya等[20]首次將槲皮素(quercetin,Q)負載的氧化石墨烯納米顆粒加入到聚己內(nèi)酯(polycaprolacton-e,PCL)中,研究表明，槲皮素的加入對PCL/GO納米纖維的抗菌性有很好的改善作用,即使在較低的GO濃度下也能顯著提高材料整體的抗菌性能,從而避免GO產(chǎn)生中毒劑量。此外,PCL/GO/Q支架具有良好的生物相容性。

(4)小檗堿:小檗堿是一種常用的抗菌劑,是從中藥黃芪、黃連、三顆針、唐松草等植物中提取的生物堿成分,可以減少細菌表面的菌毛數(shù)量,對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌都有抑制作用,有利于防止細菌附著在人體細胞上造成感染。Sun等[21]制備了多孔磷酸鈣支架,與海藻酸鈉交聯(lián),并在支架上負載小檗堿,體外研究表明,支架的細胞毒性低,有利于MC3T-3細胞的黏附和增殖,具有抗菌和骨再生功能。

(5)抗菌肽:抗菌肽(antimicrobial peptides,A-MPs)廣泛存在于動植物中,具有廣泛的抗細菌、抗病毒和抗真菌活性，與具有耐藥性問題的傳統(tǒng)抗生素比較,AMPs具有耐藥性小、高效、殺菌速度快、相對分子質(zhì)量小、熱穩(wěn)定性好、無免疫原性、對水解酶敏感度低等優(yōu)點,近年來作為傳統(tǒng)抗生素的替代品獲得了廣泛的研究。其抗菌機制是帶正電荷的抗菌肽通過吸引細菌表面的負電荷黏附在細菌細胞膜上,并且插入細菌細胞膜,導(dǎo)致細胞膜破裂,從而破壞細菌細胞膜的完整性,最終導(dǎo)致細胞死亡[22,23]。Lei等[24]將ponericinG1(從黃蜂毒液中分離得到的一種抗菌肽)固定在三維聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(la-ctic-co-glycolic acid),PLGA]支架表面,實驗結(jié)果顯示，ponericinG1的加入使支架對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抗菌活性。

二、支架載藥

Bai等[25]制備了聚己內(nèi)酯/聚乙二醇/羅紅霉素復(fù)合支架,研究發(fā)現(xiàn)，支架具有初始的短期爆裂釋放,隨后可長期持續(xù)釋放羅紅霉素,有利于預(yù)防和治療骨修復(fù)過程中的骨感染,對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有有效的抗菌活性。此外,MG63細胞在支架上表現(xiàn)出良好的生長活力。Milena等[26]制備了以羥基磷灰石、殼聚糖和慶大霉素為基體的石墨烯增強復(fù)合涂層。研究表明，慶大霉素顯著提高了涂層的抗菌活性,且涂層對MRC-5和L929細胞的毒性較低,具有良好的生物相容性。四環(huán)素是一種廣譜抗生素,對革蘭陽性和革蘭陰性菌均具有抗菌性。Dayaghi等[27]制備了含不同濃度四環(huán)素的Mg-Zn支架,研究表明四環(huán)素濃度為1%～5%的支架對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有良好的抗菌活性且生物相容性良好。

環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP)是一種廣泛用于治療骨和其他組織感染的氟喹諾酮類藥物,它在組織中具有很大的滲透性,對包括可能引起骨髓炎的銅綠假單胞菌在內(nèi)的需氧革蘭陰性桿菌有很高的抗菌活性。Luciano等[28]采用兩種方式將海藻酸鈉(sodium alginate,ALG)、羥基磷灰石和環(huán)丙沙星復(fù)合,一種方式為將預(yù)先裝載有CIP的納米顆粒添加到海藻酸鹽溶液中,制得支架命名為HA-CIP/ALG;另一種方式為將不含CIP的納米顆粒與含有2%海藻酸鹽和適當濃度CIP的水溶液混合,制得支架命名為HA/CIP-ALG。實驗結(jié)果顯示，這兩種復(fù)合材料對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌均表現(xiàn)出抗菌活性,其中HA-CIP/ALG的抗菌活性略高于HA/CIP-ALG。

三、化學改性

Sedghi等[29]研究發(fā)現(xiàn)通過銅(I)催化疊氮-炔環(huán)加成[copper(I)-catalyzed azide-alkyne cy-cloaddition,CuAAC]反應(yīng)增加殼聚糖游離胺基團的偶極矩可增加復(fù)合材料與周圍介質(zhì)的相互作用及結(jié)合能力,從而提高其抗菌活性。Wang等[30]研究表明，烷基鏈長的增加提高了殼聚糖的抗菌活性。

四、展 望

對于修復(fù)骨缺損所用的支架材料,可通過將支架與抗菌材料復(fù)合、載藥及化學改性的方法提高支架的抗菌性能。但以上方式也存在如下問題:(1)一些具有抗菌性的材料如金屬銅,具有細胞毒性,因此,控制支架中銅釋放的劑量水平以將細胞毒性降到最低是至關(guān)重要的。(2)長期應(yīng)用抗生素可使細菌產(chǎn)生耐藥性,因此,開發(fā)在細菌黏附之前就可促進新骨形成,以規(guī)避載藥支架快速出現(xiàn)的抗生素耐藥問題的生物材料是更佳方案。(3)現(xiàn)有研究中將支架應(yīng)用于動物模型的實驗較少,因此,抗菌性得到改善的支架材料應(yīng)用于臨床還需大量的基礎(chǔ)研究和臨床試驗。