從丙型肝炎疫苗研發看HCV感染后T細胞介導的免疫反應

劉柯慧 王暉

丙型肝炎病毒(HCV)感染是肝臟疾病發生和死亡的主要原因之一。全球有7 100萬慢性丙型肝炎(CHC)患者，每年死于HCV感染相關疾病的人數不少于40萬[1]。自HCV發現以來，關于其病毒學、免疫發病機制、治療等方面的研究都取得了巨大進展。直接作用抗病毒藥物(DAA)的研發和臨床應用革新了CHC的治療策略，持續病毒學應答率幾乎達到100%[1]。然而，要實現世界衛生組織2030年全球性根除CHC這一目標，仍需要預防性疫苗。本文主要探討HCV感染后T細胞介導的免疫應答，尤其是影響病毒免疫清除的相關因素、免疫失敗的機制等，這些均為成功設計疫苗需要考慮的因素。

人類和黑猩猩急性HCV感染的研究證實，適應性免疫反應與HCV感染后轉歸密切相關。HCV特異性T細胞的出現與病毒清除和肝臟疾病的發生相關[2]。適應性免疫包括B細胞、CD4+和CD8+T細胞均參與病毒清除。有報道多克隆的特異性CD4+和CD8+T細胞在感染早期已出現，這一現象甚至不因感染的不同轉歸而有差異[3]。臨床上，T細胞免疫失敗似乎很少發生，大多數患者均能誘導HCV特異性CD4+T細胞免疫反應。然而，與自發清除病毒的患者相比，CHC患者的T細胞免疫反應在頻率和廣度上下降更快[3]。因此，除了充分啟動外，持續的病毒特異性T細胞免疫反應才是實現病毒清除的關鍵因素。表型分析顯示，病毒特異性CD4+和CD8+T細胞均表達活化標記物和抑制性受體，如程序性細胞死亡-1 (PD-1)，且與轉歸無關，但表達水平隨病毒的清除而下降。此外，HCV特異性CD8+T細胞高表達CD127與病毒清除相關[4]。轉錄因子T-bet調節效應CD8+T細胞干擾素和細胞毒性因子的產生，并與病毒感染后轉歸呈正相關[5]。在慢性病毒感染狀態，T細胞向記憶T細胞的分化被阻斷，病毒特異性CD8+T細胞只保持低頻率的激活狀態并表達PD-1及其他抑制性受體。另外T細胞的信號轉錄在急性病毒清除和持續病毒感染這兩種狀態之間也存在差異。在急性持續性感染早期，病毒特異性CD8+T細胞的代謝、核小體和免疫基因等功能失調，與缺乏CD4+T細胞的輔助有關[6]。耗竭的病毒特異性CD8+T細胞中也顯示糖酵解和線粒體功能受損相關的轉錄因子顯著上調[7]。盡管有這些重要發現，但確切的免疫因素及其對病毒清除與持續病毒感染的作用機制仍未完全闡明。

對人和黑猩猩的研究表明[2]，與初次感染相比，再次感染后實現病毒清除的可能性更高，這與記憶性病毒特異性CD4+和CD8+T細胞的快速出現有關。值得注意的是，在缺乏足夠CD4+T細胞輔助的情況下，HCV感染的慢性化與病毒特異性CD8+T細胞靶向的MHCⅠ類表位出現病毒逃逸突變有關。另外CD8+T細胞的耗竭可導致病毒血癥持續時間的延長[8]。這些結果表明，CD8+T細胞是清除病毒的主要效應細胞，而CD4+T細胞的輔助亦至關重要，它可維持CD8+T細胞的免疫效應，防止病毒在CD8+T細胞靶向的表位內出現逃逸突變。這些結果進一步激發了人們對HCV T細胞疫苗的興趣，疫苗雖然不能預防再次感染，但能夠在再次感染后誘導更強的免疫反應，從而增加病毒清除的可能性。但必須指出的是，即使再次暴露于同源病毒，T細胞介導的免疫保護可能會失敗。因此，明確T細胞衰竭的機制是成功研制T細胞為基礎的HCV疫苗的前提。

HCV特異性CD8+T細胞的免疫失敗主要歸因于兩種機制：T細胞衰竭和病毒逃逸。T細胞衰竭是在抑制信號背景下抗原慢性刺激的結果，是嚴重喪失效應功能的狀態，其特征為多個抑制性受體高表達、細胞代謝改變、生存受損；并表現為獨特的轉錄程序，包括關鍵轉錄因子的改變和潛在、獨特的表觀遺傳性。從CHC患者中分離的HCV特異性CD8+T細胞大多具有這些特征[9]。在LCMV小鼠模型中已首次報道了轉錄因子TCF-1和TOX的重要生物學作用。TCF-1能夠維持病毒特異性CD8+T細胞抵抗病毒感染的慢性化[10]； TOX是免疫細胞衰竭的關鍵誘導因子，可將持久性抗原刺激轉化為特定的轉錄和表觀遺傳程序[11]。TOX的表達與PD-1等抑制性受體的表達密切相關。具體地說，TOX過度表達導致衰竭的CD8+T細胞的祖細胞亞群更易存活[11]。因此，從小鼠模型到人類免疫系統的新發現提示，HCV感染是重要的人體免疫學模型。

病毒逃逸突變是HCV應對CD8+T細胞免疫清除的結果，通常發生在感染后的前6個月。逃逸突變可導致蛋白酶功能的改變、肽表位與MHC I類分子的結合位點減少或T細胞受體的識別受損，這些均抑制CD8+T細胞對病毒的識別。長期慢性感染過程中，發生病毒逃逸突變并不常見，反映了該階段缺乏T細胞介導的選擇壓力[12]。病毒逃逸將在病毒特異性CD8+T細胞表型上留下印記[9]，也會對丙型肝炎病毒的復制能力產生影響。這種適應性突變有助于特定HLA類型的保護作用，例如HLA-B27、-B57或-A3類型，其與高水平的自發HCV清除相關[13]。顯然，不易耐受序列變異的病毒保守區域是T細胞疫苗的最佳靶點。近期研究表明，疫苗可以誘導T細胞對病毒的保守區域產生免疫效應[14]。CD8+T細胞衰竭的兩種機制，均與CD4+T細胞的反應直接相關。慢性感染時，CD4+T細胞僅以非常低的頻率存在，且增殖能力受損、PD-1和CTLA-4[3]等抑制性受體高表達。因此，缺乏足夠的CD4+T細胞的輔助可能是導致CD8+T細胞衰竭的主要因素之一。目前尚不清楚為什么持續感染狀態下CD4+T細胞不能維持應答。

DAA治療后適應性免疫恢復的關鍵問題是抗原被去除后，HCV特異性CD8+T細胞是否仍然耗盡、能否恢復其效應功能。這一問題不僅對疫苗設計，而且對研究抗原特異性T細胞免疫都非常關鍵。通過研究DAA治療患者的HCV特異性CD8+T細胞，發現以TCF-1+CD127+PD-1+表達為特征的記憶樣CD8+T細胞的祖細胞在HCV治愈后仍能被檢測到，從而實現HCV治愈后特異性CD8+T細胞功能的恢復[15]。但在病毒復發后體內抗原再激活的情況下，TCF1+CD127+PD-1+T細胞群體增多，并伴隨著終末衰竭的Eomeshi TCF1-CD127-PD-1hi HCV特異性CD8+T細胞的出現，表明至少在TCF1+CD127+PD-1亞群中存在某種記憶潛能[15]。但這些重新出現的T細胞未能清除病毒，提示DAA治療后持續存在的HCV特異性CD8+T細胞可能有缺陷，不能簡單地通過清除病毒來恢復其功能。另一項研究證實了此觀點，在DAA治療前后CHC患者中，在HCV特異性CD8+T細胞中均可檢測到決定CD8+T細胞衰竭的關鍵轉錄因子TOX，但在HCV感染自發清除的患者中未檢測到[11]。另外，對于HCV特異性CD4+T細胞的研究也獲得了相似的結果，這些細胞在DAA治療后仍保持非常低的頻率[16]。

上述研究為我們提供了HCV T細胞疫苗的重要研究基礎。預防性T細胞疫苗的概念首先在黑猩猩模型中得到驗證。接種表達所有非結構蛋白的重組缺陷型腺病毒疫苗能夠保護黑猩猩免于發生急性丙型肝炎[17]。接種疫苗后T細胞的反應出現更早、功能更強、持續頻率更高。兩種設計用于預防HCV感染的T細胞疫苗也已在人體內進行了免疫原性試驗。一種含有HCV核心蛋白和ISCOMATRIX佐劑的疫苗在健康志愿者中僅誘導出較弱的免疫反應[18]。另一種基于復制缺陷的猴腺病毒載體(ChAd3)和編碼NS3、NS4、NS5A、NS5B的改良安卡拉痘苗載體的異種增強疫苗，在I期健康志愿者的研究中發現能夠持續誘導記憶和效應T細胞群[19]。疫苗誘導的CD4+和CD8+T細胞亞群在其表型和轉錄譜上與記憶性T細胞相似，這些細胞在自發分離后保持高CD127和低Eomes表達，表明它們在遇到病毒后可迅速擴增[19]。但隨后的II期臨床研究并未顯示出該疫苗對病毒感染具有持續保護作用[20]。這一研究結果至少表明疫苗介導了一些免疫效應，還需要詳細的分析來解釋這些疫苗接種后T細胞免疫失敗的機制。疫苗設計的另一個問題是病毒不同基因型和T細胞表位的復雜性，僅覆蓋一個基因型的疫苗很難解決所有問題。

目前仍有許多問題亟待解答，例如：實現CD4+和CD8+T細胞介導的病毒清除的機制是什么？為什么這些細胞在持續感染中不能維持或只能維持在低頻率？如何才能最好地誘導保護性免疫？B細胞和中和抗體的作用是什么？對急性和慢性HCV感染的患者以及接受DAA治療或接種疫苗人群的深入研究，才能更好地破譯保護性T細胞免疫的分子、代謝和轉錄特征，從而提高對不同CD4+和CD8+T細胞亞群及肝炎病毒破壞機體免疫機制的新認知，促進疫苗研發。