外泌體在肝病診斷中的作用研究進展

劉偉 江梅 邵勇

外泌體最初是從體外培養的羊網織紅細胞的上清液中發現的，直徑30～150 nm，密度為1.10～1.18 g/mL的囊泡樣小體。研究表明，含有多種蛋白質、mRNA及miRNA各種脂類 ,可作為信息傳遞的載體 ,參與體內多種生命活動過程，成為細胞交流的一種新的方式[1]。外泌體因其獨特的有脂質雙分層膜結構[2]，能在長期極低的溫度下維持穩定狀態保護生物學特性，故用來研究多種疾病的病理生理、診斷、治療及預后。

肝臟作為人體最重要的器官之一，多種肝臟細胞均可以分泌外泌體，或做為外泌體的靶細胞，如肝細胞、膽管上皮細胞、肝星狀細胞(HSC)、單核巨噬細胞、自然殺傷T 淋巴細胞及淋巴細胞等，不同細胞分泌的外泌體有著不同的功能。外泌體參與肝癌、病毒性肝炎、肝纖維化、酒精性及非酒精性脂肪肝等疾病的發生發展，研究發現越來越多的外泌體蛋白及miRNAs是多種疾病的潛在生物標志物。本綜述總結了近年來外泌體在肝病診斷中的作用研究進展。

一、肝細胞癌(HCC)

肝細胞癌是指由肝細胞發生的惡性腫瘤，是原發性肝癌最常見的病理類型。腫瘤來源外泌體是癌癥特定信號的重要載體，并影響腫瘤生長和轉移。Sohn等[3]報道分析了慢性乙型肝炎(CHB )、肝硬化(LC)和 HCC患者血清分離的外泌體差異，HCC患者的血清外泌體miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224水平明顯高于CHB或LC患者；HCC患者的血清外泌體miR-101、miR-106b、miR-122和miR-195水平低于CHB患者。Wang等[4]研究比較30例HCC患者和30例慢性乙型肝炎病毒 (HBV ) 感染患者，HCC患者的血清外泌體含有更高水平的miR-21。 Liu等[5]比較了HCC患者與健康個體，miR-122在HCC患者中表達較低，miR-21在HCC患者中較高。目前研究發現，肝癌中miRNA-122表達降低，miRNA-21則升高，提示這兩者作為肝癌診斷的標志物的可能性，miR-122可抑制肝腫瘤的生長，這與Wu等[6]的發現一致，在體外，敲除miR-122后抑制腫瘤細胞凋亡，上調HCC細胞活力，提示miR-122有可能作為監測HCC治療效果的指標。

Sugimach等[7]發現肝細胞癌復發患者外泌體中miR-718顯著下降，提示miR-718可以作為判斷肝癌復發以及判斷肝癌治療的預后的候選標志物；Liu等[8]發現血清外泌體中的miR-125b可作為肝癌預后指標，血清外泌體miR-125b水平低的肝癌患者復發時間縮短，生存率低，他還發現外泌體miRNA (miRNA-10b, miRNA-21, miRNA-122, miRNA-200a)可能用于HCC早期階段(肝硬化)的診斷和預測，miRNA-10b在HCC發展的早期階段，表達顯著增加。在ROC曲線中，miRNA-10b預測肝硬化具有非常高的靈敏度；miRNA-21比miRNA-10b的特異性低；miRNA-122特異性與肝癌細胞增殖、遷移、分化、凋亡和血管生成相關的靶基因結合，起到抑癌和抑制肝癌發展的作用；miRNA-122a也可以用預測肝硬化；miRNA-200a在組織和血清中均隨著HCC的發展而降低，由此他們推測AFP與外泌體聯合判斷對HCC的預測能力強于單獨使用AFP。此外Ahmed等[9]發現：miR-1246和miR-210可能是區分原發與繼發性肝癌的指標：他們統計了33例原發性肝癌、22例繼發性肝癌與30例正常組對照，原發組與繼發組患者血清miR-210和miR-1246水平存在差異表達，miR-210與miR-1246在繼發性肝癌中表達均顯著高于原發性肝癌，具有統計學意義，同時他們利用ROC曲線分析miR-210在肝細胞癌與轉移性惡性腫瘤鑒別中的敏感性和特異性分別為73.7%和64.28%，而miR-1246則分別為72.2%和67.8%。

二、藥物誘導性肝損傷(DILI)

藥物引起的肝損傷，一般是有兩個途徑，第一是藥物本身的毒性引起的肝臟損害，第二，是藥物誘導的自身免疫性的肝損害。目前臨床診斷DILI主要依靠排除法，這種方法并不能很及時的診斷DILI，導致其誤診率及漏診率增加。Conde-Vancells等[10]提取了DILI大鼠與正常大鼠尿液中的外泌體發現DILI大鼠表達CD26、CD81減少，血清中這種差異卻不明顯，這可能說明某些肝病的生物標記物只能根據特定體液中分離的外泌體進行轉運。DILI時，在血漿中可檢測到肝臟來源的微小RNA (miRNAs)和全長mRNAs，其中miR-122具有肝臟特異性，敏感性高，可用于對乙酰氨基酚所致DILI的早期診斷，且其半壽期短，可更好地反映肝損傷的消退。Cho等[11]研究發現循環血漿外泌體中的miR-122 與miR-192在對乙酰氨基酚誘導的肝損傷中升高, 并且用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸處理可恢復到基礎水平，同樣提示了miR-122與miR-192作為診斷DILI指標的可能性。Zheng等[12]發現在中藥如川楝子引起的肝損傷中血清外泌體microRNA-370-3p下降明顯，這些均提示了外泌體在DILI的潛在診斷意義。

三、酒精性肝炎(AH)與非酒精性脂肪肝病(NAFLD)

酒精性肝炎是長期過量飲酒所致的一種肝臟疾病；非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關的獲得性代謝應激性肝損傷，包括單純性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相關肝硬化。miR-122在肝細胞癌中的水平降低，而在酒精性肝病中升高，血清中miR-122 水平的升高可能與肝損害有關。血漿外泌體中miRNA-30a、miRNA-192 和CD40配體均有助于診斷酒精性肝炎。Verma等[13]發現乙醇通過激活半胱天冬酶3依賴的通路，刺激肝細胞分泌含有CD40配體的外泌體，促進巨噬細胞的活化，加重肝臟的炎癥；另外一個研究[14]提示了血漿外泌體中miRNA-30a、miRNA-192有助于診斷酒精性肝炎，該研究發現miRNA -192和miRNA-30a 在長期飼飲乙醇的小鼠和慢性酒精性肝炎患者的血清中提取的EVs(細胞外囊泡)中表達均升高，在這些miRNAs中，miRNA192對酒精性肝炎的診斷準確性相對較高。Babuta等[15]發現ALD中，酒精誘導miR-155的增加，影響ALD自噬途徑中的多個基因，降低溶酶體水平，抑制溶酶體相關膜蛋白1 (LAMP1)和溶酶體相關膜蛋白2 (LAMP2)，致使溶酶體功能失調，從而導致ALD，提示miR-155也可能作為酒精性肝炎的診斷標志物。

LEE等[16]發現晚期NAFLD患者較早期NAFLD患者血清中循環外泌體miR-192的水平升高，表明miR-192可能是NASH(非酒精性脂肪性肝炎)進展相關的潛在生物標志物。Ibrahim等[17]發現在非酒精性脂肪性肝炎患者中，肝細胞能釋放含有趨化因子CXCL10的外泌體, 調節巨噬細胞的活化，加重肝臟的炎癥；Kakazu等[18]研究發現脂質可能通過刺激肝細胞分泌含有神經酰胺的外泌體，通過S1P依賴的途徑增加巨噬細胞的數量, 加重肝臟的炎癥；提示血漿外泌體中CXCL10、神經酰胺和S1P均有可能成為診斷非酒精性脂肪性肝炎的指標。

四、病毒型肝炎

病毒性肝炎是由多種肝炎病毒引起的以肝臟病變為主的一種傳染病，常見的病毒性肝炎包括乙肝與丙肝。外泌體細胞間的通信作用可參與病毒感染期間的抗病毒及免疫調節過程。有學者從丙型肝炎病毒感染患者血清中分離出外泌體，含有丙型肝炎病毒核糖核酸、高濃度蛋白質和熱休克蛋白90[19]，這些外泌體易于提取，具有一定的特異性，但目前尚未用于臨床診斷病毒性肝炎。研究發現，不同類型的病毒，如人類免疫缺陷病毒，HBV和HCV通過外泌體將信號轉導的蛋白質和功能miRNA轉移到未感染的細胞中，研究中比較20例HBV患者與對照組血清外泌體，miR-18a、miR-221、miR-222，miR-224增加，而miR-101，miR-106b 、miR-122和miR-195 減少，miR-21沒有顯著區別，提示這些蛋白質可能參與HBV的發生發展，對其診斷有一定的指導意義。還有研究發現miR-155是一種與炎癥相關的miRNA，在慢性HCV感染患者的血清和外周血單核細胞中表達水平升高，Welker等[20]發現慢性丙肝患者血清外泌體中CD81含量與炎癥活動以及肝臟纖維化嚴重程度有關。Zhao等[21]通過比較來源于HBx(HBV中HBx基因)感染的Huh7細胞及對照組外泌體的蛋白成分，發現其中含肝癌相關蛋白(如VCP)，表明血清外泌體的某些特異蛋白可作為HBV或HBV導致的肝癌的標記物。

五、肝臟纖維化

肝臟纖維化是細胞壞死以及炎癥刺激等引起肝臟細胞外基質沉積的病理過程，肝纖維化是一個病理生理過程，肝硬化是肝纖維化長期發展的晚期階段。多項研究發現肝星狀細胞(HSCs)與肝纖維化的形成密切相關，Chen等[22-23]研究發現miR-124和miR-199a-59經外泌體在HSCs間轉運，減緩肝纖維化的發展進程，在肝臟發生纖維化時，外泌體攜帶的miR-214表達降低，推測miR-214可能是一種抑制肝纖維化的的標志物，此研究還提示了血清外泌體中CTGF有助于診斷肝纖維化。Wang等[24]發現內皮細胞來源的外泌體可調節肝星狀細胞的活性；Momen等[25]發現來源于脂肪間充質干細胞的miR-122有減少HSCs的增值和分化的作用；外泌體中的miRNA-10b在肝硬化中表達增加，在肝癌階段明顯增加，可達正常水平的10倍以上。這些指標均有望在臨床上成為觀察肝纖維化早期以及進展階段的指標。

六、妊娠期肝內膽汁淤積癥(ICP)

ICP主要發生在妊娠晚期，以瘙癢和血清膽汁酸水平升高為特征。目前診斷ICP主要靠血清的膽汁酸水平。Jiang等[26]比較分析存在于ICP患者和健康孕婦尿液的外泌體，發現括miR-21、miR-29a和miR-590-3p在ICP患者和健康孕婦中有差異表達，它們的上調表達降低了細胞間黏附分子1 (ICAM1)的表達，進而增加了ICP的發生率，提示尿液中的miR-21、miR-29a和miR-590-3p可能成為ICP的新型篩選及診斷標志物。Zou等[27]發現ICP患者的miR-371a-5p、miR-6865-5p和miR-1182的表達水平顯著高于正常孕婦組，也提供了外泌體miRNA可能成為ICP診斷標志物的證據。Zhang等[28]與Rao ZZ[29]等發現miR-148a與ICP的形成有潛在的聯系。Ma等[30]發現hsa-miR-671-3p和hsa-miR-369-5p在ICP患者尿液中表達明顯上調，提示母體尿miRNAs很有可能成為ICP診斷的非侵入性新型生物標志物。

綜上所述，外泌體參與了多種肝病的發生發展過程，可能成為各種肝臟疾病發生進程、診斷、判斷治療效果及預后的指標。肝病是一個世界性的難題，微創肝活檢是大多數肝病診斷的金標準，外泌體作為新的熱點研究方向，可能成為新型、更可靠和非侵入性診斷標志物。