供體基因變異與移植后血栓形成研究進展

李姍霓，高偉，沈中陽（天津市第一中心醫院器官移植中心，天津 300192 ）

移植后血栓主要包括肝動脈血栓形成（hepatic artery thrombosis，HAT）和門靜脈血栓形成（portal vein thrombosis ，PVT），還有其他術后血管并發癥，如肺栓塞（pulmonary embolism，PE）、深靜脈血栓形成（deep vein thrombosis，DVT）、心腦血管梗死和其他靜脈血栓形成。移植后血栓形成是肝移植術后嚴重的并發癥［1-2］，可以明確地減少移植物和受者的生存期［3］，在兒童和成人的隊列研究發病率高達26%［4］，大約16%的移植物失功與血栓形成相關。移植后血栓形成的臨床技術危險因素已經在多方面得到研究和驗證，但是關于供體基因的危險因素研究少有報道。本文將近年這一領域的研究進展進行總結歸納如下。

1 基因變異與血栓性疾病

為了解靜脈血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE）的遺傳學機制，Lindstr?m 等［5］進行了VTE的 全 基 因 組 關 聯 研 究（genome-wide association studies，GWAS）和基于全血和肝臟基因表達的全轉錄組關聯研究（tranome-wide association study，TWAS）。他們對來自18 項研究的30 234 例VTE 病例和172 122 例對照組的GWAS 數據進行了薈萃分析，并評估了12 923 718 個基因變異與VTE 之間的關聯。確定了16 個新的靜脈血栓栓塞易感位點，他們從全血和肝組織中產生基因表達的變異預測分數，并評估他們與VTE 的相關性。孟德爾隨機分析了遺傳相關的性狀與新的VTE 基因座。從GWAS薈萃分析中鑒定出34 個獨立的VTE 風險遺傳信號，其中14 個是新近報道的關聯基因。這包括11個新的相關基因座（C1orf198、PLEK、OSMR-AS1、NUGGC/SCARA5、GRK5、MPHOSPH9、ARID4A、PLCG2、SMG6、EIF5A 和STX10），3 個 已 知 基因的3 個新的獨立信號。此外，TWAS 在全血（SH2B3、SPSB1、RP11-747H7.3、RP4-737E23.2）和肝臟（ERAP1）中鑒定出以上5 個額外的基因位點，其插補基因表達水平在病例和對照組之間存在差異。

Lindstr?m 等［5］也 進 行 了GWAS 的薈 萃 分 析，以 確 定VTE 易 感 基 因。12 個GWAS 共7 507 例VTE 病例受試者和52 632 例對照受試者組成了隊列研究，其中6751884 個VTE 相關單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）被測試。發現9 個基因座達到5×10-8的全基因組顯著性水平，包括6 個已知與VTE 相關的基因座（ABO、F2、F5、F11、FGG 和prorc）和3 個未被發現的基因座。這一方法識別出兩個VTE 相關基因座TSPAN15和SLC44A2 的 復 制。SPAN15 位 點 的SNPs 導 聯是內含子rs78707713，SLC44A2 導聯是非同義的rs2288904，其先前顯示與輸血相關的急性肺損傷相關。TSPAN15 和SLC44A2 不屬于血栓形成的常規途徑，也不與其他心血管疾病或相關的定量生物標志物相關。這一發現揭示了VTE 病因的意外因素，并為VTE 病理生理學的新機制概念鋪平了道路。

為了深入了解血栓性疾病的遺傳調控，Hinds等［6］進行的一項GWAS，研究對象為6 135 例血栓患者和252 827 例歐洲健康對照人群。他們發現8 個基因座超過全基因組顯著性。其中有F5、FGAFGG、F11、F2、PRORC 和ABO 基因附近這些先前已知的靜脈血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE）基因座有復制，以及最近發現的SLC44A2 附近的基因座復制具有顯著差異性。此外，他們的研究首次報告了rs114209171，它位于F8 結構基因上游，與血栓形成風險有關。對不同組織的表達譜和表達數量性狀基因座的分析表明，SLC44A2、ILF3和AP1M2 是19 號染色體基因座的3 個最可能的候選基因，這是唯一一個全基因組范圍內沒有凝血相關基因的重要血栓形成相關基因座。提供的數據顯示，這個位點也作為腦卒中和冠心?。╟oronary artery disease，CAD）的一個新的危險因素。這一觀察結果為更大規模的薈萃分析開辟了可能性，這將有助于闡明血栓性疾病的遺傳學，并為其他疾病的遺傳學研究提供了一個范例。

UK biobank 是世界上最大的歐洲個體表型和基因型信息庫。Klarin 等［7］基于這一數據庫信息對10 個VTE 相關變異體的遺傳風險評分進行的一項表型廣泛關聯研究時使用的也是F5、F2、ABO、F11 和FGG 這些先前報告的VTE 相關位點。他們鑒定出1 個新的基因座ZFPM2 rs4602861，具有全基因組顯著性（優勢比1.11；95%置信區間為1.07 ～1.15；P ＝4.9×10-10），F2 位點有一個新的獨立變異體（rs3136516；優勢比1.10；95%置信區間為1.06 ～1.13；P ＝7.60×10-9）。

GWAS 發現了導致不同程度VTE 風險增加的常見遺傳變異。抗凝基因PROC、PROS1 和SERPINC1的罕見突變導致純合子圍產期致命血栓形成，并顯著增加雜合子VTE 的風險。然而，目前所描述的靜脈血栓栓塞變異占風險的比例不足以常規用于臨床決策。為了確定新的罕見VTE 風險變異體，Desch 等［8］對393 例無原因VTE 患者和6114 例對照者進行了完整的全外顯子組測序鑒定。這項研究發現4 個基因在VTE 患者中含有過多的罕見破壞性變體：PROS1、STAB2、PROC 和SERPINC1。在STAB2，7.8%的VTE 病例和2.4%的對照組有一個合格的罕見變異。在細胞培養中，與STAB2 相比，與VTE 相關的STAB2 變體的表面表達減少。STAB2中的常見變異先前與GWAS 中的血漿血管性血友病因子和凝血因子Ⅷ水平相關，表明stabilin-2 的單倍體不足可能通過這些促凝劑水平的升高而增加VTE的風險。在一個獨立的隊列中，他們發現與對照組相比，STAB2 罕見變異個體的血管性血友病因子水平和相應的前肽水平更高。

Klarin 等［9］進行了100 萬例GWAS 以及測試了約1 300 萬個與靜脈血栓栓塞相關的DNA 序列變體（26 066 例和624 053 例對照），并對這兩項研究進行了薈萃分析，隨后進行了多達17 672 例靜脈血栓栓塞病例和167 295 例對照組人群的獨立研究。他們確定了22 個以前未知的位點，使靜脈血栓栓塞相關位點的總數達到33 個，并隨后對這些位點進行了精細定位。他們建立了一個靜脈血栓栓塞的全基因組多基因風險評分，該評分確定了5%的人群具有與已知血栓風險因子V Leiden p.R506Q 和凝血酶原G20210A 突變同樣的血栓發生風險。

Morange 等［10］記錄了靜脈血栓形成（venous thrombosis，VT）的基因決定因素，并更新了高通量基因分型和測序技術應用的最新發現。17 個基因已被證實含有與VT 風險相關的遺傳變異：ABO、F2、F5、F9、F11、FGG、GP6、KNG1、PROC、PROC、PROS1、SERPINC1、SLC44A2、STXBP5、THBD、TSPAN15 和VWF。常見的多態性僅占VT 遺傳性的一小部分（約5%）。

除凝血因子V（F5）單核苷酸多態性外，序列相似性家族134 成員B（FAM134B；rs78314670，Arg127Cys） 和 肌 球 蛋 白 重 鏈8（MYH8；rs111567318，Glu1838Ala）SNPs 與復發性室性心動過速相關（n ＝34）（假發現率校正P ＜0.05）［11］。

2 供者基因變異與移植后血栓形成

移植前凝血異常可以通過供器官移入受者體內，同時增加供受者出血和血栓風險。Ali 等［12］對活體肝移植供者的凝血和血栓因子進行了系統篩查，檢測了因子VLeiden，凝血酶原G20210A 和MTHFR 基因C667T 突變。發現供者有輕度凝血異常時，移植后血栓和出血風險都會顯著增加。供者有中度凝血異常也會引起移植術中大出血。有血栓性缺陷的患者可能在術后早期發生靜脈血栓。

來源于供肝凝血路徑的遺傳性基因變異會通過手術移植入受者體內，這是不可避免的，再加之終末期肝病患者自身移植術前的血液高凝狀態與來源于供肝的獲得性遺傳基因變異風險因素相結合，就會導致移植血栓風險進一步增加［13］。

既 往 研 究 報 道 供 肝 中 的 V Leiden 或 因 子ⅩⅢG100T 與移植后HAT 相關［14］。一項研究報告了一例肝移植后HAT 患者的原肝和供肝均出現雜合子FVL［15］。有些報道稱由于供肝FVL 突變而獲得的活化蛋白C 抵抗，導致移植后血栓并發癥［16］。最近一項584例的病例報道稱428例中有33例 （8%）病例因為血管并發癥原因被排除入組，主要是血栓問題。有趣的是，同樣一項關于156 例活體肝移植的研究中有13 例發生血栓，但沒有1 例進展為血管并發癥［17］。

Li 等［18］對供體血栓性基因的遺傳變異與移植后血栓形成的風險增進行了全基因組關聯研究。他們對1993 年— 2018 年間接受肝移植的775 例成人和310 例兒童的供者全部進行了基因分型，來分析供者的已知的血栓相關基因變異對移植后血栓形成的影響。此外，他們還對上述1085 例肝移植進行了GWAS 和薈萃分析。在供體隊列中，已知的血栓風險位點與移植后血栓形成無關，這表明不需要基于血栓易感多態性來排除肝臟供者。通過這一項兒童和成人的薈萃GWAS 分析研究，他們在預示遺傳意義閾值的55 個位點中確定了280 個變異，下游優先策略識別生物學上可信的候選基因，其中AK4（rs11208611-T，P ＝4.22×10-5），該蛋白編碼一種調節細胞ATP 水平的蛋白質，并抑制 AMPK 和mTOR 的電流激活，另一個是RGS5 （rs10917696-C，P ＝2.62×10-5），它參與了血管的發育。他們提供的證據表明，這些供者遺傳變異之前沒有被證實與血栓性疾病相關，恰恰說明這些是肝移植后血栓形成風險增加相關的特有遺傳變異。

之后的GWAS 對基因變異與靜脈血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE） 風 險 增 加 的相關性進行分析。這些研究一致地確定了編碼因子V Leiden（F5）、ABO、F11、FGG、F2、 蛋 白C（PROC）、PROS1、SERPINC1、STAB2、ZFPM2、TSPAN15、SLC44A2、prorc、STXBP5 和F Ⅷ 的基因與SNPs 的關聯，這引起了人們對遺傳學在肝移植后血栓形成中的作用的興趣。因此如果沒有對供者進行全基因組學分析，就會導致供體遺傳學在肝移植術后血栓形成中的真正作用認知有限。

為了評估了供體中已知的血栓基因變異對移植后血栓形成的影響，他們用全基因組芯片檢測供體常見血栓基因變異與移植后靜脈血栓的相關性，然后整合了關于組織特異性表達、共表達、已確定候選基因疾病關聯的公開獲取數據，對這些基因的可能致病機制進行了深入分析。為了闡明血栓形成與遺傳風險之間的相關性，他們報告了OLT 后血栓形成的危險因素和增加的風險奇數比率（odd ratios，ORs）和所選風險變量的統計值，或連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）高水平的代用變體，還進行了12 項基于基因的測試來研究已知的血栓相關基因對肝移植術后血栓風險的影響?；谖墨I，他們檢測了以下血栓相關基因：ABO、F5、F2、FGG、F11、PROC、STAB2、ZFPM2、TSPAN15、SLC44A2、PROCR 和STXBP5， 即之前報道過的VTE 相關基因，他們分析了每個基因100 kb 范圍內的所有變體，并分析了這些變異與肝移植術后血栓形成的關系。

通過已知的VTE 基因研究觀察供者基因變異體的影響，檢測到163 個相關的變體或代理變體proxy variants。在候選基因中，其中一個變體（rs1336472-G）超過了Bonferroni 校正值3.1×104與SNP×SNP 相互作用。Bonferroni 校正后，沒有一個獨立的變異與移植后血栓形成風險有顯著關聯。為了評估OLT 隊列中先前報道的血栓形成風險基因的患病率和影響，檢測了含有12 個已建立的血栓相關基因（ABO，F5，F2，FGG，F11，PROC，STAB2，ZFPM2，TSPAN15，SLC44A2，PROCR，and STXBP5），發現血栓危險基因區共檢測到65 個位點，其中，沒有一個變種超過Bonferroni 校正7.7 ×104，這表明這些血栓形成相關基因不能被用作普遍的基因風險標志來預測移植后血栓風險。 為了探討已經建立的VTE 風險變體的影響，對捐獻者隊列進行了PRS 分析，也沒有發現統計學差異。

2.1 全基因組與移植后血栓形成：根據供者基因型用GWAS 薈萃分析對106 例成人和兒童病例進行了分析。這些分析基于500 萬個基因變異使用1 kg 參考面板進行基因分型或插補，并通過了廣泛的質量控制。分析分為3 個階段進行：第一階段兒童原位肝移植隊列（42 例與268 個對照組）；第二階段成人OLT 隊列研究（64 例與711 例對照組）；第三階段聯合薈萃分析。在主要薈萃GWAS 中，鑒定了280 個基因變異具備顯著性，共有55 個位點（表S5）。Genomic inflation factor （λGC）基 因 組 膨 脹 因 子是0.988，對兒童和成人GWAS 結果顯著不同的變異進行篩選后，得到40 個基因loci 兒童和成人隊列兩組間一致（兩組均P ＜0.05）。這40 種遺傳風險基因變異解釋了29%的移植后血栓形成。對供體吸煙和血管重建的校正并未改變分析結果。

2.2 移植后血栓亞群的遺傳關聯：為了說明血栓形成的合理性和有效性結果，再次檢查了3 種生物學上由所有血栓性亞群驅動最可能的變異（rs11208611、rs10917696 和rs1965492）。我們對血栓形成亞組進行了遺傳關聯分析，包括HAT、PVT和其他血栓形成，隨后進行薈萃分析3 個血栓亞組。比較各血栓亞組rs11208611、rs10917696 和rs1965492 的關聯結果，發現rs10917696 主要由HAT（P ＝1.54×10-4） 和其他血栓驅動（P ＝2.68×10-3）。為了說明PRS 對不同血栓亞群和短期生存率的影響，再用薈萃GWAS 比較HAT 和PVT 亞群的PRS計算結果顯示在HAT 和PVT 之間PRS 無顯著性差異，這說明了供者基因因素會導致所有血栓，結果不是有HAT、PVT 或其他血栓驅動的。此外，根據血栓性事件計算的PRS 是短期移植物衰竭的患者更高（P ＝7.8×10-6）［19］。

總之，供肝中既往報道的血栓性基因變異在他們的移植供受者研究隊列中，沒有顯著增加OLT 后血栓形成的風險。新發現了3 個新的候選基因與移植后血栓形成有關［19］。首先是AK4 （rs11208611-T，P ＝4.22×10-5），這是一個高度保守的基因，編碼許多腺苷酸激酶。這種酶富含在組織中，在大腦、心臟、腎臟和肝臟線粒體中表達，它通過與ADP/ATP 易位酶的相互作用間接調節線粒體膜的通透性，44AK4 通過磷酸化和調控細胞ATP 水平發揮作用AMPKα2 可能影響Fyn 磷酸化，而Fyn 磷酸化在血小板α Ⅱbβ3 整合素信號轉導中起關鍵作用，導致血栓收縮和血栓穩定。重要的是，該變異在高LD和重復的VTE 相關變異（rs1336472）中，AK4 之前曾被報道為發生VTE 的風險基因。第二個候選基因是RGS5，它編碼G 蛋白信號傳導（RGS）家族的一個調控成員，RGS 蛋白是一種信號轉導分子，它參與了免疫球蛋白的形成通過作為GTPase 活化調控異三聚體G 蛋白。RGS5 被報道為調控血管平滑肌細胞（smooth muscle cells，SMCs）的增加重建側支動脈。它已被確定為血管重塑的關鍵調控因子，但尚未在任何血栓栓塞 GWAS 中報道。第三個被識別的基因是ETFA，編碼線粒體脂肪酸-氧化中的一個電子受體。ETFA 與給定的“動脈或靜脈血栓形成”表型相關，并且是正常線粒體脂肪酸氧化和氨基酸代謝所需。

關于供者基因變異與移植后血栓形成的相關研究還有待進一步深入，這將有助于擴大肝臟捐獻者范圍，有效預防術后并發癥。