代謝組學在缺血性腦卒中方面應用的研究進展

劉蕾 ，蒙蘭青2，歐陽揚，劉玥彤

(1. 右江民族醫(yī)學院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000)

卒中作為神經(jīng)內(nèi)科最常見的疾病，致殘率、死亡率居于各種疾病之首[1]，其中，缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)占腦卒中的69.6%～70.8%[2]，是最常見的卒中類型。IS患者因腦組織血流量急劇下降，導致一系列腦缺血后級聯(lián)反應[3]。IS發(fā)病機制復雜，目前認為機體代謝紊亂是IS的關(guān)鍵事件之一[4]。代謝組學是繼基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學后的一大新興組學，通過定量對生物體內(nèi)不同狀態(tài)下的代謝產(chǎn)物進行動態(tài)分析，可明確生物體不同代謝產(chǎn)物與相應生理、病理狀態(tài)的關(guān)系。運用代謝組學對IS不同樣本進行代謝物的變化分析，對揭示IS的發(fā)病機制、診斷、治療有著至關(guān)重要的意義。現(xiàn)就近年來IS的代謝組學研究作一綜述，旨在為IS的研究提供思路。

1 代謝組學概述

代謝組學的概念由Nicholson JK于1999年首次提出[5]，是衡量生物體在應對內(nèi)在或外在因素單一作用或聯(lián)合作用下代謝物作出響應的一項技術(shù)，定量對生物體內(nèi)代謝產(chǎn)物進行分析，可發(fā)現(xiàn)不同生理或病理狀態(tài)下代謝產(chǎn)物的變化，從而明確代謝產(chǎn)物與相應生理、病理狀態(tài)的關(guān)系。代謝組學目前已廣泛應用于生命科學各個領(lǐng)域，應用于疾病的病理生理過程、診斷、治療、藥效分析及新藥研制等各個方面的研究。隨著相關(guān)研究的不斷深入以及相關(guān)環(huán)節(jié)升級與完善，代謝組學有望成為指導人類疾病診斷和治療的有效手段。

2 代謝組學在IS方面的研究應用

2.1 病理生理機制 IS的病理生理機制復雜，至今尚未明確，涉及能量代謝異常、氧化應激、氨基酸代謝紊亂、脂質(zhì)代謝異常等方面。

2.1.1 能量代謝異常 能量代謝功能障礙被認為與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)[6]。缺血缺氧的狀態(tài)下，腦組織進行三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))的能力下降，腦組織中葡萄糖分解成丙酮酸的量超過了三羧酸循環(huán)的能力，剩余的丙酮酸通過糖酵解途徑還原成大量乳酸[7]。Ding Y等[8]采用大腦中動脈梗塞(MCAO)大鼠模型模擬人體IS的病理生理變化，發(fā)現(xiàn)MCAO組大鼠的血清乳酸水平較假手術(shù)組明顯增高，大量乳酸積聚，導致缺血性腦損傷。除此之外，作為三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物的琥珀酸、富馬酸鹽水平明顯下降[9]，間接反映機體三羧酸循環(huán)受到抑制，機體無法提供足夠的能量。Zhang Q等[10]運用核磁共振氫譜(1H NMR)技術(shù)檢測MCAO大鼠代謝狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)大鼠體內(nèi)丙酮酸、檸檬酸水平均降低，乳酸水平升高，缺血時腦組織的葡萄糖、氧氣供應受限，葡萄糖通過電子傳遞鏈ETC介導的有氧代謝活動受到抑制，產(chǎn)生的丙酮酸減少，進入三羧酸循環(huán)的丙酮酸減少，檸檬酸水平隨之降低。劉玉敏等[11]發(fā)現(xiàn)，在腦組織缺血缺氧時，腦組織中與糖異生、糖酵解有關(guān)的代謝物水平顯著升高，而與三羧酸循環(huán)有關(guān)的代謝物顯著降低。通過糖異生及糖酵解途徑來供給能量有限，酮體將作為替代的能量底物，參與供給能量。

2.1.2 氧化應激 腦缺血再灌注損傷是造成IS腦損傷的重要原因。研究表明，IS發(fā)生后，活性氧(ROS)的產(chǎn)生迅速增加，機體的氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，大量的ROS通過自由基氧化的形式破壞包括神經(jīng)細胞在內(nèi)的各種腦細胞，引起細胞死亡，然后血流的快速恢復增加了機體氧合的能力，大量的ROS再次暴增，再一次加重腦組織的損傷[12-15]。因此，氧化應激損傷在IS腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，參與腦缺血后損傷的進展。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)是評價氧化應激的重要敏感指標[16]，丙二醛是間接反映生物體內(nèi)ROS自由基攻擊細胞的程度，而超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶是體內(nèi)重要的抗氧化酶。Chen LL等[17]驗證氫氣對IS的保護作用與氧化應激的相關(guān)性時，發(fā)現(xiàn)MCAO模型組大鼠體內(nèi)的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶含量相比于假手術(shù)組顯著降低，而丙二醛含量則顯著升高，提示機體的抗氧化能力明顯下降，過多的ROS、自由基攻擊缺血的腦細胞，導致了腦缺血損傷。Ma WB等[18]在MCAO模型大鼠上也觀察到了上述同樣的現(xiàn)象。有學者進一步探討谷胱甘肽代謝與氧化應激的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠體內(nèi)谷胱甘肽的含量明顯下降，谷胱甘肽是生物體內(nèi)重要的抗氧化劑，可清除體內(nèi)的ROS及自由基，保護巰基不受氧化，而谷胱甘肽含量的降低作為一個潛在的早期凋亡激活信號，提示機體抗氧化能力降低，引起后續(xù)的細胞凋亡現(xiàn)象，與氧化應激密切相關(guān)[19-20]。Luo L等[21]對MCAO模型組大鼠血漿樣本進行代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)樣本中乳酸(Lac)、三甲胺-N-氧化物/甜花堿(TMAO/Bet)含量升高，而極低密度脂蛋白/低密度脂蛋白(VLDL/LDL)、3-羥丁酸(3-Hb)、乙酰乙酸(Acac)和多不飽和脂肪酸(PUFA)含量顯著降低，這些代謝物的改變均與丙二醛、超氧化物歧化酶密切相關(guān)，與氧化應激有密切聯(lián)系。除此之外，尿酸、牛磺酸、肉堿及其酰酯、溶血磷酸、谷氨酸、N-乙酰天冬氨酸等代謝物也參與了IS的氧化應激，其代謝途徑主要涉及嘌呤代謝、牛磺酸代謝、線粒體能量代謝和磷脂代謝[22-26]，然而，目前通過干預氧化應激治療IS的臨床藥物較少，但可以明確的是，氧化應激的有效干預可以減輕腦損傷，甚至阻止腦損傷的發(fā)生，極大改善患者預后，可能是前景研究的主要方向。

2.1.3 氨基酸代謝紊亂 氨基酸代謝異常是IS最顯著的代謝特征，氨基酸的顯著變化貫穿了腦缺血的整個病理生理過程，Xu J等[27]通過動態(tài)分析MCAO大鼠不同時間點腦脊液中氨基酸含量變化，驗證了IS不平衡的氨基酸代謝網(wǎng)絡。

谷氨酸作為一種興奮性氨基酸，維持著各種生理活動的正常進行，但高濃度的谷氨酸則過度激活谷氨酸受體，破壞血腦屏障，一方面抑制神經(jīng)功能的恢復，另一方面則加劇神經(jīng)元損傷[22-23，28]。Wang D等[24]研究發(fā)現(xiàn)急性IS患者血清中谷氨酸水平升高，而甘氨酸則明顯降低，甘氨酸是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，IS發(fā)生后，由于神經(jīng)興奮毒性作用下，可能抑制了抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，導致了氨基酸代謝異常。除此之外，參與缺血性腦組織炎癥代謝過程的苯丙氨酸/酪氨酸[25]及產(chǎn)生抑制性神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺的色氨酸含量也發(fā)生了改變，這與Hu ZC等[26]的研究結(jié)果保持一致，認為可能與產(chǎn)生大量的谷氨酸影響神經(jīng)突觸傳遞有關(guān)。支鏈氨基酸在維持能量平衡、合成谷氨酸等[29]方面具有重要作用，Liu PF等[30]研究發(fā)現(xiàn)支鏈氨基酸水平在IS患者中普遍降低，Holmes MV等[31]指出高水平的支鏈氨基酸提示未來發(fā)生IS的風險增加，支鏈氨基酸水平的變化反映IS的發(fā)生發(fā)展。不僅如此，高水平的谷氨酸也源于賴氨酸的分解代謝增強，這與Wang D等[24]發(fā)現(xiàn)IS患者體內(nèi)賴氨酸水平普遍明顯降低的結(jié)論保持一致。Luo L等[32]運用1H NMR技術(shù)發(fā)現(xiàn)MCAO大鼠腦內(nèi)的天冬氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)含量升高，N-乙酰天冬氨酸(NAA)、N-乙酰天冬氨酸谷氨酸(NAAG)含量降低，腦缺血損傷后天冬氨酸產(chǎn)生增加，正反饋促進GABA的產(chǎn)生，NAA水平的降低提示腦缺血損傷狀態(tài)下出現(xiàn)大量神經(jīng)細胞元丟失，NAA的降低進一步影響了NAAG產(chǎn)生，NAAG的降低又可抑制GABA的釋放[33]。

綜上所述，氨基酸代謝紊亂在IS病理生理過程中扮演著重要的角色，氨基酸代謝水平變化提示IS的發(fā)生發(fā)展。

2.1.4 脂質(zhì)代謝異常 脂質(zhì)是生物細胞膜的主要成分，起穩(wěn)定細胞膜的作用，缺血性腦損傷時，神經(jīng)細胞膜的穩(wěn)定性出現(xiàn)破壞，脂質(zhì)代謝出現(xiàn)異常。Ding Y等[8]基于超高液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q/TOF-MS)代謝組學技術(shù)對MCAO模型組大鼠進行代謝物檢測，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)數(shù)量及含量均發(fā)生明顯的降低，與Jickling GC等[34]的研究結(jié)果一致，提示IS出現(xiàn)脂質(zhì)代謝異常。鞘磷脂作為脂質(zhì)中的一類，是細胞膜的重要組成部分，在神經(jīng)細胞軸突周圍的髓鞘含量豐富。Manicke NE等[35]在動脈粥樣硬化的標本中檢測到了鞘磷脂的存在，Sun N等[36]觀察到IS后鞘磷脂活性發(fā)生改變，鞘磷脂代謝出現(xiàn)異常。為了進一步研究鞘磷脂水平與IS之間的關(guān)系，Lind L等[37]發(fā)現(xiàn)IS患者血漿鞘磷脂含量出現(xiàn)變化，且與IS嚴重程度呈現(xiàn)負相關(guān)，提示IS出現(xiàn)鞘磷脂代謝異常。Sun HX等[38]對IS患者進行代謝組學分析發(fā)現(xiàn)溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPE)、磷脂酰絲氨酸(PS)的含量明顯降低，提出磷脂代謝在IS的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。大腦中有大量的多不飽和脂肪酸隨著甘油磷脂代謝釋放出來，如花生四烯酸等，可氧化產(chǎn)生各種脂質(zhì)介質(zhì)，維持機體代謝平衡。Wang Y等[39]通過氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)技術(shù)發(fā)現(xiàn)MCAO模型大鼠血漿中以花生四烯酸、亞油酸為主的13種不飽和脂肪酸水平均發(fā)生顯著變化。腎上腺酰乙醇胺(NAE)作為脂肪酸的衍生物[40]，在腦缺血狀態(tài)下，迅速大量合成，較正常情況下濃度增加約30倍[41]。

2.2 生物學標志物 代謝組學是尋找IS區(qū)別于健康人群的疾病信號即生物學標志物的理想工具。近年來，大量差異代謝物被提出具有成為IS生物學標志物的潛力，但缺乏明顯的疾病特異性。氨基酸是IS發(fā)生后受影響最大的一類代謝物，Ormstad H等[25]對IS患者血清樣本進行高效液相色譜分析，發(fā)現(xiàn)IS患者血清中苯丙氨酸(Phe)含量明顯降低，酪氨酸(TYR)含量及苯丙氨酸/酪氨酸比值均顯著升高；并且Phe/TYR比值的靈敏度及特異度均較高，分別為76%和85%，并與炎癥因子IL-6、IL-1β有關(guān)，提出Phe/TYR聯(lián)合白細胞介素炎癥因子作為IS的生物學標志物的可能價值。Wang D等[24]提出酪氨酸、乳酸、色氨酸聯(lián)合指標作為急性IS潛在生物學標志物的準確性高達91.7%，特異性明顯高于一般的缺血指標。Lind L等[37]運用液相色譜質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝物鞘磷脂(32：1)與腦缺血事件之間呈負相關(guān)關(guān)系，推測鞘磷脂(32：1)可能是缺血性事件一個潛在的生物學標志物。不僅如此，多不飽和脂肪酸水平也被提出在IS方面具有潛在的生物學標志物價值，Wang D等[24]運用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)驗證多不飽和脂肪酸(PUFA)與IS的關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)花生四烯酸及亞油酸多不飽和脂肪酸可作為IS生物學標志物，并與IS呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系。新的生物學標志物應用于臨床需要克服疾病的異質(zhì)性及疾病特異性、敏感性等多方面的問題，這也是目前IS研究需要克服的難題之一。

2.3 鑒別診斷 頭暈/眩暈是后循環(huán)缺血常見的癥狀，以頭暈/眩暈為首發(fā)癥狀的就診患者容易誤診為其他疾病。Sun RT等[42]將頭暈/眩暈為主訴分為后循環(huán)缺血患者和非卒中患者納入研究，運用代謝組學的方法鑒別出了58個差異代謝物，提出肉堿和精氨酸可能是IS鑒別診斷核心代謝物。急性IS和腦出血臨床表現(xiàn)相似，但治療方案完全相反，快速鑒別兩者在臨床上至關(guān)重要。為此，Zhang XX等[43]研究篩選出11種差異性代謝物，并提出酰肉堿、氨基酸及其比值組合代謝物在鑒別腦出血和腦梗死方面的潛在價值，其快速診斷準確率高達87.38%，但目前仍處于實驗階段，需要臨床大樣本研究進一步驗證。

2.4 治療 由于IS復雜的神經(jīng)生物學機制，中藥以多成分多靶點的特點成為最有前景的治療方法之一。Liu YT等[44]基于1H NMR技術(shù)發(fā)現(xiàn)，黃芪-丹參配伍的中藥方劑可顯著回調(diào)8種因腦缺血而發(fā)生顯著變化的血清代謝物，并在后續(xù)的神經(jīng)缺損體征的恢復具有顯著效果。Wang Y等[39]基于氣相色譜-質(zhì)譜代謝組學技術(shù)發(fā)現(xiàn)，蒺藜總皂苷可有效糾正IS引起的氨基酸、脂質(zhì)代謝紊亂。徐敉等[45]研究發(fā)現(xiàn)，血府逐瘀湯可有效改善氨基酸代謝、鞘磷脂代謝及丁酸代謝異常，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。Wang RJ等[46]基于UPLC-Q/TOF-MS技術(shù)探究刺五加治療IS機制，共鑒定出42種與缺血性卒中相關(guān)的生物學標志物，其中有38種可被刺五加有效調(diào)節(jié)，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。除此之外，氫氣作為一種新的方式在治療IS方面也具有潛在應用價值。Chen LL等[17]利用UPLC-Q/TOF-MS代謝組學技術(shù)發(fā)現(xiàn)氫氣干預下顯著回調(diào)了腦缺血狀態(tài)下發(fā)生變化的29種小分子代謝物，并顯著改善神經(jīng)缺損癥狀。

3 小結(jié)與展望

代謝組學在闡明IS病理生理機制的同時，在尋找新的生物學標志物、鑒別診斷、治療等研究方面具有潛在的應用前景。但不同的研究樣本及代謝分析平臺，研究數(shù)據(jù)有差異；代謝物極不穩(wěn)定，容易受內(nèi)外在因素的影響，研究結(jié)果出現(xiàn)偏差，限制代謝組學的應用。隨著代謝組學技術(shù)和生物信息學技術(shù)的發(fā)展，高通量、高靈敏性代謝分析檢測平臺的開發(fā)，代謝組學以其系統(tǒng)性的研究思維將在IS的研究中得到更好的應用。