基于大腸桿菌O157:H7 快速檢測技術的研究綜述

賈亦琛，初浩展

（1.齊齊哈爾醫學院醫學技術學院，黑龍江 齊齊哈爾 161000；2.青島科技大學，山東 青島 266000）

1 大腸桿菌0157：H7與人類的關系

大腸桿菌（學名：Escherichia coli (T.Esc herich 1885)）是由Escherich 在1885 年發現的，絕大多數的大腸桿菌和人類都有著良好的合作關系，不僅可以競爭性抵御致病菌的攻擊，還可以幫助人體合成維生素K。但仍有少數血清型為致病性的大腸桿菌存在于食物和人們的飲用水中，危害著人們的生活，尤其是對抵抗力尚不完善的兒童，危害很大。大腸桿菌O157:H7 就是其中一種，它致病性極強且能產生志賀樣毒素從而引起人體的出血性腸炎，一旦感染主要表現有劇烈的腹痛和便血，嚴重的還會出現溶血性尿毒癥甚至死亡[1]，所以這種能危及生命的致病菌已被食品衛生主管部門視為常規檢測的項目。因此具有能快速檢測病菌的技術，可以有效保證人們的食品安全問題，本文以此為背景對生鮮中的大腸桿菌O157:H7 的快速檢測方法進行論述，為保證生鮮的質量，提高人們的食用安全提供思路。

2 現有的微生物檢測技術

目前傳統的細菌檢測方法有直接的涂片觀察，使用選擇或鑒定培養基分離鑒定細菌，血清學鑒定和分子生物學鑒定的方法。平板培養法在各個領域都有著廣泛的應用，細菌培養和生化鑒定的方法步驟簡單而且費用低，可直接根據細菌的代謝特點，在培養基中加入指示劑，從而通過顏色變化直接鑒定細菌的種類。但是該方法耗時長、操作過于繁瑣、靈敏性也相對較低[2-3]。正是由于傳統的檢測方法存在不足，越來越多的學者利用微流控芯片加載各種化學成分，對病原微生物的檢測以及體外診斷進行研究。胡慧等[4]利用實時定量熒光快速檢測法，對大腸桿菌0157:H7 的特異基因設計出一對特異的引物進行合成制作實時熒光檢測PCR 檢測模板，從而建立SYBR Green I 進行實時定量檢測。該方法的建立能夠特異、靈敏地對大腸桿菌O157:H7 做出檢測，且是封閉式操作過程，大大減少了雜菌的污染；斯城燕等[5]通過一種基于表面存在的離子共振(surface plasmon resonance，SPR)，選用了BIACORE 3000 系統和葡聚糖加以修飾的CM5 芯片，經處理后用于大腸桿菌O157:H7 的檢測，使檢測更加準確、高效且操作簡單；葛萃萃等[6]通過檢測發現10mg/mL 純化的抗大腸桿菌O157:H7lgY 抗體其效價為1:320，然后再通過免疫大白兔得到兔抗大腸桿菌抗體其效價達1:25600，再以兔抗大腸桿菌的抗體作稀釋3000 倍處理作為一種捕獲抗體，從而為檢測抗體建立了雙抗夾心ELISA 的方法；該方法具有較好的敏感性能和特異性。趙遠洋等[7]發現該技術在鏈置換型DNA 聚合酶的作用下，對已有的目的基因的特異性進行高效的復制。王麗等[8]分別針對大腸桿菌O157:H7 的三個特異性基因rfbE，stx1 和stx2 的8 個靶區分別設計了內、外和環引物從而進行LAMP 擴增檢測，該項技術通過Bst DNA 聚合酶在恒溫條件下從而實現靶基因自循環鏈置換成合成反應，引物識別基因6 或者8 個獨立的區域，同時與PCR 進行結果對比，其結果表現出比傳統PCR 高10 倍以上的靈敏度及特異性，該實驗方法的操作簡便，具有較高的靈敏性和特異性，能快速地檢測出細菌。

3 微流控芯片研究進展

微流控的加工最重要的是依托微電子技術，采用的是標準軟刻蝕工藝，就是在玻璃的基板上旋涂光膠，從而來遮擋含有的微通道圖形掩膜，再經過曝光和顯影后才得到的模具。微流控芯片之間具有良好的電絕緣、散熱和光學等特性，它可以攜載生物大分子，對于檢測信號的干擾非常的小，而且它的制作工藝也比較簡單，成本低，裝置也具有微型化、系統集成化和反應時間短等等特點。目前新型的微流控技術已經在核酸分離和定量分析等領域有廣泛的應用，在蛋白質、多重PCR、LAMP、原位熒光等領域也有了一定成熟的檢驗技術，其基于免疫分析的原理主要是以抗原、抗體還有熒光靶目標為新型的標記物。

目前越來越多的實驗者嘗試使用3D 打印技術對微流控芯片進行加工和修飾，該技術使得微流控的發展更加快速，制作過程也更加簡便。此前已有研究通過使用微流控芯片來實現DNA 的快速分離，通過在微流控芯片上加入各種化學反應，從而可應用于藥物合成以及篩選，并且微流控技術已被國外許多醫療機構應用在體外診斷方面，并取得明顯突破。還有科研人員通過PCR 的全自動分子診斷，發現了微流控芯片發展的巨大潛能和發展方向。在當今時代，器官芯片的研究也已成為一大熱門，并在2016 年還入選了十大新興科技之一，目前國內外都已研發出能使多種細胞組織體外共存的器官芯片[9]。

4 微流控技術在檢測病原體方面的應用

利用微流控芯片可進行多種病原體和病毒的快速檢測，在微流控的蛋白質免疫分析法當中，通過電滲流分離以及紫外分光光譜等檢測技術，使待測樣本在原先設定好的檢測程序的芯片上自動完成檢測，從而使整體的反應效率大大提高；通過生物的光信號學與適配體之間的相互作用的特性，大大縮短了檢測的時間，這對于臨床檢測來說無疑是一大利處；以及廣東醫科大學先前所研發出的微流控芯片核酸分析系統、免疫化學發光分析系統等，可通過程序化的步驟完成細胞的裂解、核算的結合、磁珠的洗滌等一系列操作，該芯片可用于檢測淋病奈瑟菌、沙眼衣原體等；關于負壓驅動皮升級等溫核酸精確定量實驗中應用了新的芯片結構，其芯片中采用了氟硅烷納米涂層，可有效地防止反應過程中水蒸氣的流失，保證了目標分子的正常進行，從而精確定量目標分子，在進行微流控芯片制作時可使用該方法從而得到改進，使之能更快速簡便地檢測出大腸桿菌。由于芯片的操作簡單及富有多樣性，微通道可根據不同種類特點的病原進行針對性加強設計，這種技術已在病原體的檢測領域得到高速的發展和廣泛的應用。

但目前微流控芯片的發展仍然存在著不足：①相關研究人員的不足，導致其發展進程得不到快速提升；②微流控技術的產品不夠成熟，缺乏配套的芯片驅動平臺以及檢測模塊等相應的系統組件，由于技術的不太成熟導致產品缺少規范和標準化，無法實現組件的通用化；③存在一定的技術難題，目前抗體等生物分子可通過疏水吸附在疏水性的微管通道表面，但可導致抗體的構象發生改變從而導致活性、靈敏度降低，另外微流控芯片和外圍設備的自動分析、設備顯示的集成化也是需要攻克的難題。

5 微流控芯片的發展趨勢和展望

5.1 趨勢

微流控芯片是90 年代分析化學領域中逐漸發展起來的一種分析方法，它是以化學分析為基礎，輔以微機電加工技術，再以網絡管道加以修飾為結構特點，以生命科學為主要研究應用方向，其主要目標是把整個化學化驗室的功能都集成在一塊微小的芯片上，從而實現便捷、高效、重復利用等優勢，使之更具有廣泛的應用性和發展前景。隨著微流控技術的廣為人知以及其所具有的潛在發展前景，許多科研實驗者已報道采用多相層流的技術去實現芯片對實驗樣品的無膜過濾、滲析和萃取分離等，也有學者通過微加工完成微流控質譜分析前試樣前處理操作，以及將其制作成過濾器、檢測細菌等應用產品。其特點是高效、自動化以及集成性高和便捷化，從而可大大降低珍貴試驗樣品的消耗，以及大大提高分析的速度，降低成本，能夠普及到千家萬戶。

5.2 展望

近二十年來，研究人員提出過許多有關快速檢測細菌的方法，比如基于免疫學、核酸以及生物傳感器等等的方法，但這些方法都仍然存在著許多缺陷，無法滿足臨床及社會的需求。從目前發展前景來看，微流控芯片技術已經突破了原有的發展技術所遇到的難題，現在正在進入一個更深的研究層次，不斷地擴大應用范圍，挖掘更多可以應用的領域，以及更深度的產業化發展模式。相信在未來的幾年，以微流控芯片為核心的技術將應用于更多的分析檢測領域，為人們的生活提供更加便捷、高效健康的檢測產品。